ラッパムシの再生の研究のための方法

1.ラッパムシの養殖と単一細胞または細胞断片からラッパムシ文化の確立 ラッパムシのための食糧として使用されるクラミドモナス文化を準備します。 (材料表) の商業製造者からクラミドモナス細胞を取得します。 生殖不能の技術13を使用して市販のタップ メディアのクラミドモナスの 500 mL の液体培養を確立します。 週 2 回タップ メディアでそれを薄めて (約 1 の外径) で飽和に近い濃度でランプの下でクラミドモナス文化を保ちます。注:クラミドモナス文化は、シェーカーで栽培できます。 スライド上の文化のドロップを配置し、coverslip でそれを覆う、40 倍の倍率での顕微鏡の下でそれをチェック、クラミドモナス文化が健康かどうかを定期的にチェックします。注:ラッパムシの餌それが細菌で汚染されている場合、またはクラミドモナス細胞、クラスターに集約されるカルチャを使用しないでください。これらの問題のいずれかが発生した場合は、新しいクラミドモナス文化を開始します。 (材料表) の商業製造者からラッパムシ青斑核細胞を取得します。 ラッパムシ細胞は、その自然の生息地から必要な場合は、池や湖、川11から収集します。 池や湖、川からラッパムシを収集、水は比較的穏やかな日陰に、明確ないくつかの植生の領域を見つけます。注:ラッパムシ藻が育つ場所でを見つけることのより高い確率があります。 注ぎやすい容器に水の少なくとも 2 リットルを収集します。 デトリタスと粒子状物質は、容器の底に解決して後は、優しくラッパムシ、大型コンテナーで解決するデトリタスの各コレクションの後、数秒間待ってをチェックするいくつかの小さな容器を入力します。 場所でサンプルのコレクションを完了すると、少なくとも 10 m は、新しい場所に移動し、そこのサンプルのコレクションを繰り返します。注: すべての池、ラッパムシ人口サンプリングする複数の池があります。 サンプル研究室に返され、個々 のペトリ皿にコンテナーから水を移します。 各ペトリ皿 5 倍の倍率で斜めの光で実体顕微鏡下ラッパムシを検索します。市販の殺菌春水 (PSW) の少なくとも 100 μ L を含むガラス スポット プレートのウェルに 1 mL ピペットを使用して個々 のラッパムシセルを転送します。注: 基板 (図 1) に接続されているとき、ラッパムシ細胞はラッパのような形をしています。スイミングラッパムシセルがセル基板 (ビデオ 1) に接続されているより少ない拡張です。 PSW 少なくとも 3 でラッパムシを洗う x。よく、ラッパムシ細胞を維持しながら井戸からの水の約 90% を除去することによって洗浄を実行に PSW の 500 μ L を追加することによって続きます。注:ラッパムシピペット ピペット チップ 10 μ L 以下での使用を処理する前にカット大細胞を通過、生成されるせん断力による細胞の負傷を避けるためにハサミでピペット チップの端から約 0.5 mm 先端 op の小さすぎます。社。 ラッパムシのそれぞれの餌の前に、クラミドモナスを準備します。 手順 1.1 のように 1.5 mL 遠心チューブに準備クラミドモナス文化の 1 mL に転送します。3 min に 2,095 × g で遠心分離機します。 上澄みを除去し、PSW の中の 1 mL にペレットを再停止されます。3 分削除上澄み 2,095 × g で遠心し、PSW の 500 μ L でペレットを再懸濁します。注: このように、洗浄、濃縮クラミドモナスが以下の手順で「クラミドモナス覚悟」と呼ばれます。タップ メディアは、ラッパムシ、ラッパムシを給餌は重要な前に従ってクラミドモナスを洗濯に有害です。 クローンラッパムシ培養が必要な場合は、個々 のラッパムシセルまたはセル フラグメントから文化を開始します。 ラッパムシ単細胞が PSW でよく育たないので、既存の健康ラッパムシ文化からメディアの 500 μ L の滅菌フィルター エアコン メディアを準備します。 調節されたメディアの 500 μ L をスポット ガラスの井戸の 1 つに転送します。 エアコンのメディアを含むガラス スポット プレートのウェルに 1 つラッパムシを転送します。転送を行うため、できるだけ小さな媒体として使用します。 すべての 48 h 準備クラミドモナスの各ラッパムシ5 μ L をフィードします。ラッパムシを分割、井戸のセルの数をカウントし、準備クラミドモナス細胞 1 個あたりの 5 μ L を追加します。 セル (たとえば、明確なプラスチックの箱は、紙タオルで覆われている)、光に敏感であるので、日陰の場所にラッパムシをしてください。 新鮮な馴化培地毎の 96 h とよくラッパムシ培地を交換します。 1.5.1 のステップのように新鮮な調節されたメディアを準備します。 優しく上下に井戸の液体をピペッティングにより井戸の底からデタッチすべてのラッパムシセルを作る。 慎重によく使用して井戸に残っているすべてのセルを確かめる 1 mL ピペットから液を吸引します。井戸の中に新鮮な調節されたメディアの 500 μ L を追加します。 井戸のセルの数が 20 を超えたら、大規模なコンテナー、広口のガラス瓶などにセルを移動します。 オートクレーブの広口のガラス瓶に PSW の 20 mL を追加します。注:ラッパムシのガラスのオートクレーブは慎重に洗浄とすすぎで置き換えることができます。 慎重にピペット メディアの井戸の底からすべてのセルをデタッチするのには井戸の中を上下。1 mL のピペット チップを使用してすべてのラッパムシ細胞を収集し、そっとガラス瓶にそれらを転送します。 ラッパムシ文化、空気へのアクセス権を許可すると瓶の蓋を締めください。 約 20 のセル/mL でラッパムシ密度を保つために瓶ごとの 48 h に PSW を追加します。目で細胞密度を推定します。注: また、瓶の中に文化の 1 mL をピペットの壁から外し、ピペット チップ内のセルの数をカウントするセルを作成するのにバブルの空気に 1 mL ピペットを使用します。 すべての 48 h フィード覚悟クラミドモナスラッパムシ文化 jar ファイル (手順 1.4 参照)。準備クラミドモナスの 200 μ L で文化を給餌を開始します。文化のボリュームが増えると、1 mL を餌用に準備クラミドモナスの量を徐々 に増やします。 文化ボリューム瓶の容量の約 90% に達すると、文化をより大きい容器に転送します。 1 mL ピペット ガラスからラッパムシをデタッチすると、jar ファイル内にある文化の上下、ピペットします。 Jar ファイルの内容全体を 2 カップ ガラス製の容器に注ぐ。 PSW の残りラッパムシを収集する 2 カップ ガラス容器に約 25 mL の瓶をすすいでください。 2 カップ ガラス容器の健全な文化を維持します。 フィードラッパムシ文化 2 mL 準備クラミドモナス文化の 100 mL あたりのすべての 4-5 日。約 20 のセル/mL でラッパムシ密度を保つためにすべての 4-5 日ガラス容器に PSW を追加します。注: 450 mL、2 カップ コンテナーを保持している最大のボリュームです。 週に一度、ワムシ、真菌、および他の成長のために顕微鏡を切り裂く X 5 の下で文化を検査します。文化の健康を長引かせる、1 mL ピペットを使用して異常形と無色のラッパムシセルとともに汚染微生物を削除します。 ガラス容器が約 90% と、文化を分割します。 PSW の 25 mL をガラス容器に追加します。ガラスからラッパムシをデタッチするのには、上下 25 mL ピペット、ピペットを使用します。新しい 2 カップ ガラス容器に文化の約 50% に移動します。 両方の文化に PSW の 25 の mL を追加し、プロトコルのこのセクションで説明するように、2 つの文化を維持し続けます。注:ラッパムシ細胞は高い温度に敏感なので文化が保管されている部屋の温度 25 ° c 以下を維持します。また、文化は、インキュベーターで保つことができます。ラッパムシ養殖のトラブルシューティングの表 1を参照してください。 2. 切削ラッパムシ細胞による再生を誘導します。 針の引き手を使用してプログラムを次のように使用して毛細管からいくつかの針: 熱 – 735、プル – 100、速度 – 110、時間 – 150、圧力 – 400。 PSW の 50 mL で 4% セルロース溶液を準備します。 セルロースの 1 グラムを追加 (粘度: 1500 cP) PSW 50 mL に。 セルロースの溶解を容易にするために、少なくとも 8 時間のための 4 ° C で孵化させなさい。 室温で 4% セルロース溶液を維持します。 カットを実行した後、細胞の断片を格納するためガラス スポット プレートを準備します。 フィルターは、メディアから健全な文化、よく必要とするガラス スポットあたり 500 mL を滅菌します。 それぞれ必要な井戸の滅菌メディアの 500 mL に転送します。 2 μ L の液滴の 1 つ健康ラッパムシ(定義されたトランペット形状、鮮やかな青緑色で、ない大きな液胞を持つ) を収集し、coverslip またはスライドの上に置きます。4% メチル セルロース (図 2) の 2 μ L を追加します。ラッパムシ(動画 2) を切断する前に減速ができます。 針を壊すようにできるだけ切削表面に平行としてガラス針を保持します。 解剖顕微鏡ステレオを使用して、ガラス針の先端を見つけて近く (図 3 a) セルに移動します。(図 3 b、C) の針と接触、ラッパムシ契約を観察します。注: 困難の後端から前方を分離する方向にセルがある場合は、それを回転させる非常に優しく針の側面と。 2 つのセルをカットするガラス針の側で契約ラッパムシを軽くを押して(図 3 D と E、ビデオ 3)。フラグメントの融合を避けるために、それらの間の細胞質の接続がないことを確保する別の 2 つのフラグメントを移動 (図 3 f)。 両方のフラグメントは斜光と解剖顕微鏡の下で破片を調べることによって各少なくとも 1 つのゾウリムシ ノードであるかどうかを確認します。注: は、細胞の生存に不可欠なゾウリムシ ノードが少なくとも 1 つを持っていることです。中またはカット後、セルは青顔料と共にそのペリクル (透明なシェル) を当てることがあります。ほとんどの場合、これは細胞の長期生存率を与えません。 ステップ 2.3 で作製したガラス スポット プレートのウェルにフラグメントを移動します。 切り取ったセルの一部は再生成されませんので、複数セルを切り取る。 1 つのセッションで複数のカットを実行すると、それが大きくラッパムシ残渣や、その先端が壊れたでコーティングしたときガラス針を交換してください。また、シリコンのスペーサーの部分の上に優しくそれを拭くことによって針をきれい。注: 複数セル切断セッションのガラス針を使用できます。 湿度チャンバーに細胞断片でガラス スポット プレートをしてください。 イメージングの詳細についてはプロトコルのセクション 4、ラッパムシ再生結果の解釈に進みます。 3. Membranellar バンド ・ スクロース ・尿素処理による口腔装置の再生を誘導します。 ショ糖を用いた Membranellar バンドと口腔装置の除去 PSW でショ糖の 25% 溶液を準備します。 スナップ キャップ付き微量遠心チューブに PSW で 25% 蔗糖の 500 μ L を追加します。 スクロース処理後セルを洗浄の PSW の中の 1 ml の各管内スナップ キャップが 3 マイクロ遠心チューブ用を準備します。 1 mL ピペット (図 4矢印 A) を使用して別の遠心管に 1 mL の培地で 30-60ラッパムシ細胞を収集します。 200 μ L ピペットを使用して単一の抽選で 125 μ L 最終巻でチューブからすべてのセルを収集します。625 μ 20% ショ糖液 (図 4矢印 B) を取得する (ステップ 3.1.2 の準備) 25% ショ糖の 500 μ L でチューブに転送します。ストップウォッチを起動します。 この 20% ショ糖液とフリック スピン ラック 1 分の遠心チューブラッパムシを孵化させなさい。 1 回の描画でのすべての細胞を収集 (200 μ L 最大能力簡単にコレクションにピペットを調整)。 ストップウォッチ表示スクロース処理の 2 分までピペット チップで細胞を維持します。 3.1.3 (図 4矢印 C) の手順で作製したマイクロ遠心チューブ用のいずれかにラッパムシを取り出します。ラックにチューブをフリック-スピン。 2 回以上一度 PSW を含むマイクロ遠心チューブ用の残りの 2 つのそれぞれの準備手順 3.1.3 (図 4D と E の矢印) でセルを洗浄します。注: 単一のセル コレクション手法は洗浄の間に重要ではありません。 イメージングの詳細についてはプロトコルのセクション 4、ラッパムシ再生ダイナミクス (図 4F と G の矢印) の解釈に進みます。 尿素を用いた Membranellar バンドと口腔装置の除去 PSW で 4% 尿素の溶液を準備します。 スナップ キャップ付き微量遠心チューブに PSW で 4% 尿素の 300 μ L を追加します。 スナップ キャップ 1 mL PSW の尿素処理後セルを洗浄の各管内を含む 3 マイクロ遠心チューブ用を準備します。 1 mL ピペット (図 4矢印 A) を使用して別の遠心管に 1 mL の培地で 30-60ラッパムシ細胞を収集します。 1 回の描画で 1 mL ピペットを使用して 300 μ L 最終巻でチューブからすべてのセルを収集します。2% 尿素溶液 (図 4矢印 B) 600 μ L を取得する 4% 尿素 (3.2.2 の手順で準備) の 300 μ L でチューブに転送します。ストップウォッチを起動します。 この 2% 尿素とフリック スピン ラック 1 分の遠心チューブラッパムシを孵化させなさい。 1 回の描画のすべてのセルを収集します。 ストップウォッチ表示尿素処理の 2 分までピペット チップで細胞を維持します。 3.2.3 (図 4矢印 C) の手順で作製したマイクロ遠心チューブ用のいずれかにラッパムシを取り出します。ラックにチューブをフリック-スピン。 2 回以上一度 PSW を含むマイクロ遠心チューブ用の残りの 2 つのそれぞれの準備手順 3.2.3 (図 4D と E の矢印) でセルを洗浄します。注: 単一のセル コレクション手法は洗浄の間に重要ではありません。 イメージングの詳細についてはプロトコルのセクション 4、ラッパムシ再生ダイナミクス (図 4F と G の矢印) の解釈に進みます。 4. イメージングと細胞の再生を分析 正立型顕微鏡を使用すると、ぶら下げ場合個々 のセルの画像再生するドロップレット法。 スポット ガラスの十分に PSW の 100 μ L を入れてください。 文化メディア (彼らは、メディア) の 4 μ L で 1 つラッパムシのセルを分離、ピペット 10 または 20 μ L を使用します。22 × 22 mm2 coverslip (図 5) の真ん中に液滴を入金します。注: セルを 1) 不健全なかどうか (異常形または重く胞) または 2) まだ membranellar バンドや口腔装置 (化学治療実験) のため、画像を使用しないでください。 液滴間の十分なスペースを残しながら以前の液滴中の文化メディアラッパムシの 4 の滴を配置します。 滴と coverslip の反転し、優しく PSW が手順 4.1 で追加されたガラス スポットの井戸の上に置きます。 注: 井戸の PSW は、(図 5) 液滴の蒸発を最小限になります。 イメージング手順 4.1.1 – 4.1.4 で残りのセルを準備します。 再生細胞を必要な時間分解能を持つ顕微鏡をイメージします。また、解離性の実体顕微鏡を用いた再生を確認します。注: セル切断または蔗糖あるいは尿素による治療直後に再生が開始されます。ただし、表示される新しい口腔構造は再生の初めの後約 3 h を形成します。 各時点の各セルに 3 つの再生の段階の 1 つを割り当てます。これを行うには、各セル (図 4および図 6) 段階を示す代表的な画像を比較します。 (図 6 a) まだ membranellar のバンドを持っていない細胞にステージ 1 を割り当てます。 Membranellar バンドとセルにステージ 2 を割り当てます。注: membranellar バンド (図 4図 6 b) 治療後 3-6 時間が表示されます。このステージの一番最後に、membranellar バンドの後部の端の湾曲率が増加オーラル原基が表示される直前に表示されます。 経口原基の細胞にステージ 3 を割り当てます。注: 口腔の原基は、陥入 membranellar バンド (図 4図 6 と 6 D) の後端で治療後 6-8 時間を表示します。セルは前方端と特徴的なトランペットのセル形状 (図 4,図 6 e) で membranellar バンドを持っている場合、再生は完了します。ラッパムシのほとんどの細胞は、再生の開始以来 8-9 h の内で完全に再生されます。 各積み上げボックス プロット (図 7) の形で各時点の再生段階のセルの割合をプロットします。注意: このタイプのプロットは、細胞の人口の再生のダイナミクスの可視化をできます。