Metodi per lo studio della rigenerazione in Stentor

1. coltura Stentor e instaurazione delle colture Stentor da singole cellule o frammenti di cellule Preparare la Chlamydomonas reinhardtii cultura per essere utilizzato come alimento per Stentor. Ottenere cellule Chlamydomonas reinhardtii da un fornitore commerciale (Tabella materiali). Stabilire una cultura liquida 500 mL di Chlamydomonas reinhardtii in supporti di rubinetto commercialmente disponibili usando una tecnica sterile13. Mantenere la cultura di Chlamydomonas sotto una lampada ad una concentrazione vicino a saturazione (a diametro esterno di circa 1) diluendo con rubinetto media due volte a settimana.Nota: La cultura di Chlamydomonas possa essere coltivata su un agitatore. Controllare regolarmente se la cultura di Chlamydomonas è sana mettendo una goccia di cultura su una diapositiva, coprendolo con un vetrino coprioggetto e archiviandola sotto un microscopio a ingrandimento 40x.Nota: Non utilizzare le impostazioni cultura per Stentor alimentazione se fosse stato contaminato da batteri o cellule Chlamydomonas sono aggregate in cluster. Se si verifica uno di questi problemi, avviare una nuova cultura di Chlamydomonas . Ottenere Stentor coeruleus cellule da un fornitore commerciale (Tabella materiali). Se le cellule Stentor sono necessari dal loro habitat naturale, è possibile raccoglierle da uno stagno, un lago o un fiume11. Per raccogliere Stentor da uno stagno, lago o fiume, individuare un’area con alcuni vegetazione dove l’acqua è relativamente calmo, ombreggiato e chiaro.Nota: C’è una maggiore probabilità di trovare Stentor presso le sedi dove cresce la lenticchia d’acqua. Raccogliere almeno 2 L di acqua in un contenitore che è facile da versare da. Dopo detriti e particolato sono depositati alla parte inferiore del contenitore, delicatamente riempire pochi contenitori più piccoli da esaminare per Stentor, in attesa di pochi secondi dopo ogni raccolta per i detriti di stabilirsi nel grande contenitore. Una volta ultimata la raccolta di campioni in una posizione, spostare in una nuova posizione che è di almeno 10 m di distanza e ripetere il prelievo di campioni ci.Nota: Non ogni stagno ha una popolazione di Stentor , così possono avere molteplici stagni da campionare. Ritorno con i campioni al laboratorio e trasferire l’acqua dai contenitori nei singoli piatti Petri. In ogni capsula di Petri, cercare Stentor sotto uno stereomicroscopio con luce radente a 5 ingrandimenti. Trasferire le singole celle Stentor , utilizzando una pipetta da 1 mL in un pozzetto di una piastra di vetro posto contenente almeno 100 µ l di acqua di sorgente pastorizzato disponibile in commercio (PSW).Nota: Stentor cellule hanno una forma di tromba-come quando sono collegati a un substrato (Figura 1). Nuoto Stentor cellule sono meno estese rispetto alle cellule attaccate ad un substrato (Video 1). Lavare Stentor in PSW almeno 3 x. Eseguire i lavaggi rimuovendo circa il 90% dell’acqua dal pozzo, mantenendo le cellule Stentor nel pozzo, seguito aggiungendo 500 µ l di PSW nel pozzo.Nota: Prima di maneggiare Stentor utilizzando pipette con puntali da 10 µ l o più piccoli, tagliare l’estremità della punta della pipetta con le forbici per evitare di ferire le cellule grazie alle forze di taglio che vengono generate come una grande cellula scorre attraverso circa 0,5 mm troppo piccolo di un op di punta ening. Preparare Chlamydomonas prima di ogni poppata di Stentor. Trasferire 1 mL di coltura di Chlamydomonas preparato come passaggio 1.1 in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL. Centrifugare a 2.095 x g per 3 min. Eliminare il surnatante e risospeso il pellet in 1 mL di PSW. Centrifugare a 2.095 x g per 3 minuti rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 500 µ l di PSW.Nota: Così, lavato e concentrato Chlamydomonas deve essere indicato come “preparato Chlamydomonas”nei passaggi seguenti. RUBINETTO media è dannoso per Stentor, così lavaggio Chlamydomonas prima alimentazione Stentor è importante. Se è necessaria una cultura Stentor clonale, la cultura a partire da una singola cella di Stentor o un frammento di cella. Poiché celluli Stentor non crescono bene in PSW, preparare terreni condizionati dal filtro sterilizzante 500 µ l di contenuti multimediali da una cultura di Stentor esistente, sana. Trasferire 500 µ l di media condizionati in uno dei pozzetti di una piastra di vetro posto. Trasferire un Stentor nel pozzetto della piastra spot vetro contenenti terreni condizionati. Utilizzare come piccolo mezzo possibile per effettuare il bonifico. Alimentazione ogni Stentor 5 µ l di preparati Chlamydomonas ogni 48 h. Quando si dividono Stentor , contare il numero di cellule nel pozzo e aggiungere 5 µ l di preparati Chlamydomonas per cella. Tenere Stentor in un luogo ombreggiato, poiché le cellule sono sensibili alla luce (ad esempio, in scatole di plastica trasparente rivestito con carta assorbente). Cambio Stentor medium nel pozzo con fresco medium condizionato ogni 96h. Preparare fresco media condizionati come descritto al punto 1.5.1. Rendere tutte le celle di Stentor staccare dal fondo del pozzo pipettando delicatamente il liquido in su e giù nel pozzo. Aspirare accuratamente il liquido dal bene utilizzando una pipetta da 1 mL, assicurandosi che tutte le cellule rimangono nel pozzo. Aggiungere 500 µ l di fresco media condizionati al pozzo. Quando il numero delle cellule nel pozzo è superiore a 20, è possibile spostare le cellule in un contenitore più grande, ad esempio, un vaso di vetro a bocca larga. Aggiungere 20 mL di PSW in un vaso di vetro di bocca larga in autoclave.Nota: In autoclave di cristalleria per Stentor può essere sostituita con attenzione di lavaggio e di risciacquo. Attentamente pipettare i media su e giù nel pozzo per staccare tutte le cellule dal fondo del pozzo. Raccogliere tutte le celle di Stentor utilizzando una pipetta da 1 mL e trasferirli delicatamente il barattolo di vetro. Non serrare i coperchi su barattoli con culture Stentor , per consentire l’accesso sufficiente all’aria. Aggiungere PSW nel barattolo ogni 48 h per mantenere Stentor densità a circa 20 cellule/mL. Stimare la densità delle cellule dall’occhio.Nota: In alternativa, utilizzare una pipetta da 1 mL di aria bolla nel barattolo per rendere le celle staccare dalle pareti, pipetta da 1 mL della cultura e contare il numero di cellule nella punta della pipetta. Ogni 48 h, mangimi preparati Chlamydomonas Stentor culture in vasetti (Vedi punto 1.4). Iniziare con la cultura con 200 µ l di preparati Chlamydomonasdi alimentazione. Man mano che aumenta il volume della cultura, aumentare gradualmente la quantità di preparato Chlamydomonas utilizzato per l’alimentazione fino a 1 mL. Quando il volume di cultura raggiunge circa il 90% della capacità del vaso, è possibile trasferire la cultura in un contenitore più grande. Dispensare la cultura all’interno del vaso, su e giù, con una pipetta da 1 mL per staccare Stentor dal vetro. Versare l’intero contenuto del vaso in un contenitore di vetro 2-cup. Sciacquare il vaso con circa 25 mL di PSW nel contenitore di vetro 2-tazza per raccogliere il restante Stentor. Mantenere sane culture in contenitori di vetro 2-cup. Nutrire le colture Stentor 2 mL di preparato Chlamydomonas per 100 mL di cultura ogni 4-5 giorni. Aggiungere PSW nel contenitore di vetro ogni 4-5 giorni per mantenere Stentor densità a circa 20 cellule/mL.Nota: 450 mL è il volume massimo che tiene un contenitore di 2 tazze. Una volta a settimana, ispezionare le culture sotto un 5 X microscopio per rotiferi, funghi e altre crescita di dissezione. Per prolungare la salute della cultura, rimuovere microrganismi contaminanti insieme con le cellule Stentor anormalmente a forma e incolore, utilizzando una pipetta da 1 mL. Quando il contenitore di vetro è riempito al 90%, dividere la cultura. Aggiungere 25 mL di PSW nel contenitore di vetro. Utilizzare una pipetta per pipetta di 25 mL su e giù per scollegare Stentor dal vetro. Circa il 50% della cultura di spostamento in un nuovo contenitore di vetro 2-cup. Aggiungere 25 mL di PSW in entrambe le culture e continuare a mantenere le due culture come descritto in questa sezione del protocollo.Nota: Poiché le cellule Stentor sono sensibili alle alte temperature, mantenere la temperatura a 25 ° C o inferiore in camera dove sono custodite le culture. In alternativa, le culture possono essere tenute in un’incubatrice. Fare riferimento alla tabella 1 per la risoluzione dei problemi di coltura Stentor . 2. che inducono la rigenerazione di cellule Stentor taglio Utilizzare un estrattore di ago per fare parecchi aghi da tubi capillari utilizzando il programma come segue: pressione calore – 735, pull – 100, 150, velocità – tempo 110, – – 400. Preparare una soluzione di metilcellulosa 4% in 50 mL di PSW. Aggiungere 1 g di metilcellulosa (viscosità: 1500 cP) a 50 mL di PSW. Incubare a 4 ° C per almeno 8 h facilitare la dissoluzione della metilcellulosa. Mantenere la soluzione di metilcellulosa 4% a temperatura ambiente. Preparare una lastra di vetro posto per riporre i frammenti delle cellule dopo aver eseguito i tagli. Filtro sterilizzare file multimediali da una cultura sana, 500 mL per vetro posto piastra ben necessario. Trasferire 500 mL di terreno sterilizzato in ciascuno dei pozzetti necessari. Raccogliere un sano Stentor (avendo una forma definita tromba, colore blu-verde vibrante e senza grandi vacuoli) in una goccia di 2 µ l e posto su un vetrino coprioggetto o diapositiva. Aggiungere 2 µ l di metilcellulosa 4% (Figura 2). Lasciate che Stentor rallentare prima del taglio (Video 2). Tenere l’ago di vetro come parallela alla superficie di taglio possibile prevenire la rottura dell’ago. Utilizzando uno stereo microscopio per dissezione, individuare la punta dell’ago di vetro e avvicinarlo alla cella (Figura 3A). Osservare il contratto Stentor al contatto con l’ago (Figura 3B e C).Nota: Se la cella è un orientamento che fa che separa la parte anteriore dal lato posteriore difficile, ruotarlo molto delicatamente con il lato dell’ago. Premere delicatamente il contratto Stentor con il lato dell’ago di vetro per tagliare la cella in due (Figura 3D e Video 3). Spostare i due frammenti apart assicurando che non ci sia alcuna connessione citoplasmatica tra di loro, per evitare la fusione del frammento (Figura 3F). Verifica se entrambi i frammenti hanno almeno un nodo macronuclear ogni esaminando i frammenti sotto un microscopio per dissezione con illuminazione obliqua.Nota: Avere almeno un nodo macronuclear è essenziale per la sopravvivenza delle cellule. La cella potrebbe far sua pellicola (guscio trasparente) insieme con il pigmento blu-verde, durante o dopo il taglio. Nella maggior parte dei casi, ciò non influirà la redditività a lungo termine della cella. Spostare i frammenti nei pozzetti di una piastra di vetro posto preparato nel passaggio 2.3. Taglio più celle perché una frazione delle cellule del tagliare non si rigenera. Se eseguendo tagli multipli in un’unica sessione, è necessario sostituire l’ago di vetro quando esso diventa pesantemente rivestito con Stentor residuo o quando la sua punta è rotta. In alternativa, è possibile pulire l’ago strofinando delicatamente su un pezzo di distanziatore di silicio.Nota: Gli aghi di vetro possono essere utilizzati per più sessioni di taglio delle cellule. Mantenere la lastra di vetro posto con frammenti di cellule in una camera umida. Procedere alla sezione 4 del protocollo per i dettagli su formazione immagine e interpretazione dei risultati di rigenerazione Stentor . 3. indurre rigenerazione della Band Membranellar e apparato orale di saccarosio o trattamento di Urea Membranellar band e orale rimozione apparato utilizzando saccarosio Preparare una soluzione al 25% di saccarosio in PSW. Aggiungere 500 µ l di 25% di saccarosio in PSW ad un tubo del microcentrifuge con una capsula. Preparare 3 microcentrifuga con Salvapercussori con 1 mL di PSW in ciascuna provetta per il lavaggio delle cellule dopo trattamento di saccarosio. Raccogliere 30-60 Stentor cellule in 1 mL di loro terreni di coltura in una microcentrifuga separato utilizzando una pipetta da 1 mL (Figura 4, freccia A). Raccogliere tutte le celle dal tubo in 125 µ l di volume finale utilizzando una pipetta di 200 µ l in una singola estrazione. Trasferirli al tubo con 500 µ l di 25% di saccarosio (preparato al punto 3.1.2) per ottenere 625 µ l di soluzione di saccarosio al 20% (Figura 4, freccia B). Avviare un cronometro. Incubare Stentor in questa soluzione di saccarosio al 20% e flick-spin il tubo del microcentrifuge nel rack per 1 min. Raccogliere tutte le celle in una singola estrazione (regolare la pipetta di capacità massima di 200 µ l per raccolta più facile). Mantenere le cellule nella punta della pipetta fino a quando il cronometro mostra 2 min di trattamento di saccarosio. Espellere Stentor in uno dei tubi del microcentrifuge preparati al punto 3.1.3 (Figura 4, freccia C). Flick-spin il tubo nel rack. Lavare le cellule due volte, una volta in ciascuna delle due restanti microcentrifuga contenente PSW preparata al punto 3.1.3 (Figura 4, frecce D ed E).Nota: Singola estrazione cellulare collezione tecnica non è importante tra i lavaggi. Procedere alla sezione 4 del protocollo per i dettagli su formazione immagine e interpretazione delle dinamiche di rigenerazione Stentor (Figura 4, frecce F e G). Membranellar band e orale rimozione apparato utilizzando urea Preparare una soluzione di urea 4% in PSW. Aggiungere 300 µ l di 4% di urea in PSW ad un tubo del microcentrifuge con una capsula. Preparare 3 microcentrifuga con Salvapercussori contenente 1 mL di PSW in ciascuna provetta per il lavaggio delle cellule dopo trattamento di urea. Raccogliere 30-60 Stentor cellule in 1 mL di loro terreni di coltura in una microcentrifuga separato utilizzando una pipetta da 1 mL (Figura 4, freccia A). Raccogliere tutte le celle dalla provetta a 300 µ l di volume finale utilizzando una pipetta da 1 mL in una singola estrazione. Trasferirli al tubo con 300 µ l di 4% di urea (preparato al punto 3.2.2) per ottenere 600 µ l di soluzione di urea 2% (Figura 4, freccia B). Avviare un cronometro. Incubare Stentor in questo 2% soluzione di urea e flick-spin il tubo del microcentrifuge nel rack per 1 min. Raccogliere tutte le celle in una singola estrazione. Mantenere le cellule nella punta della pipetta fino a quando il cronometro mostra 2 min di trattamento di urea. Espellere Stentor in uno dei tubi del microcentrifuge preparati al punto 3.2.3 (Figura 4, freccia C). Flick-spin il tubo nel rack. Lavare le cellule due volte, una volta in ciascuna delle due restanti microcentrifuga contenente PSW preparata al punto 3.2.3 (Figura 4, frecce D ed E).Nota: Singola estrazione cellulare collezione tecnica non è importante tra i lavaggi. Procedere alla sezione 4 del protocollo per i dettagli su formazione immagine e interpretazione delle dinamiche di rigenerazione Stentor (Figura 4, frecce F e G). 4. imaging e l’analisi di rigenerazione delle cellule Se utilizzando un microscopio in posizione verticale, utilizzare l’impiccagione metodo goccia per la rigenerazione dell’immagine di singole celle. Mettere 100 µ l di PSW in un pozzo di una lastra di vetro posto. Isolare 1 Stentor cella a 4 µ l di cultura media (il media che si trovano in), utilizzando un 10 o 20 µ l pipette. Depositare la goccia nel mezzo di un vetrino coprioggetto2 di 22 x 22 mm (Figura 5).Nota: Se le cellule che sono 1) malsani (forma anomala o fortemente vacuolato) o 2) ancora hanno bande di membranellar o apparecchi orali (per esperimenti di trattamento chimico), non utilizzare per l’imaging. Organizzare 4 goccioline più di Stentor in terreni di coltura intorno la gocciolina precedente, lasciando abbastanza spazio tra le goccioline. Invertire il coprioggetto con le goccioline e delicatamente posto sopra il pozzetto della piastra vetro posto a cui PSW è stato aggiunto nel passaggio 4.1. Nota: PSW nel pozzo riduce al minimo l’evaporazione delle goccioline (Figura 5). Preparare le celle rimanenti per l’imaging seguendo passaggi 4.1.1 – 4.1.4. Immagine le cellule rigenerante sotto un microscopio con la risoluzione di tempo desiderato. In alternativa, osservare la rigenerazione utilizzando un microscopio stereo da dissezione.Nota: Rigenerazione inizierà immediatamente dopo il taglio di cella o trattamento con saccarosio o urea. Tuttavia, visibili nuove strutture orali formerà circa 3 h dopo l’inizio della rigenerazione. Per ogni punto di tempo, una delle tre fasi di rigenerazione assegnare a ciascuna delle celle. Per effettuare questa operazione, confrontare ogni cella per le immagini rappresentative che illustrano le fasi (Figura 4 e Figura 6). Assegnare Stage 1 per le cellule che non hanno ancora una band membranellar (Figura 6A). Assegnare Stage 2 per le cellule con una banda di membranellar.Nota: Viene visualizzata una banda di membranellar 3-6 h dopo il trattamento (Figura 4, Figura 6B). Alla fine di questa fase, un’ulteriore curvatura dell’estremità posteriore della band membranellar apparirà appena prima che venga visualizzato un primordio orale. Assegnare Stage 3 per le cellule con un primordio orale.Nota: Un primordio orale è un’invaginazione che appaiono 6-8 h dopo il trattamento all’estremità posteriore della band membranellar (Figura 4, Figura 6 e 6D). Rigenerazione è completata quando le cellule hanno una banda di membranellar alle loro estremità anteriore e la forma di cellulare caratteristica tromba (Figura 4, Figura 6E). Maggior parte delle cellule Stentor sono completamente rigenerata all’interno di 8-9 h dall’inizio della rigenerazione. Tracciare la percentuale delle cellule in ciascuna delle fasi di rigenerazione per ciascun punto di tempo sotto forma di un impilati box plot (Figura 7).Nota: Questo tipo di grafico permette la visualizzazione delle dinamiche di rigenerazione in una popolazione delle cellule.