Méthodes pour l’étude de la régénération de Stentor

1. culture de Stentor et établir les Cultures de cellules individuelles ou des Fragments de cellules de Stentor Préparer Chlamydomonas reinhardtii culture à utiliser comme nourriture pour Stentor. Cellules de Chlamydomonas reinhardtii provenir d’un fournisseur commercial (Table des matières). Établir une culture liquide 500 mL de Chlamydomonas reinhardtii dans les médias de robinet disponibles dans le commerce à l’aide de la technique de stérilisation des13. Conserver la culture de Chlamydomonas sous une lampe à une concentration proche de la saturation (à diamètre extérieur d’environ 1) par dilution avec robinet médias de deux fois par semaine.Remarque : La culture de Chlamydomonas peut être cultivée sur un agitateur. Vérifiez régulièrement si la culture de Chlamydomonas est saine en plaçant une goutte de culture sur une diapositive, couvrir avec un lamelle couvre-objet et vérifier au microscope au grossissement de X 40.Remarque : Ne pas utiliser la culture pour Stentor alimentation si elle est contaminée par des bactéries ou si Chlamydomonas cellules sont regroupées en grappes. Si un des ces problèmes se produit, démarrez une nouvelle culture de Chlamydomonas . Cellules de Stentor coeruleus provenir d’un fournisseur commercial (Table des matières). Si les cellules de Stentor sont nécessaires dans leur habitat naturel, leur rassemblement d’un étang, lac ou rivière,11. Pour collecter les Stentor d’un étang, lac ou rivière, trouver une zone avec une végétation où l’eau est relativement calme, ombragé et claire.Remarque : Il y a une probabilité plus élevée de trouver Stentor aux endroits où pousse les lentilles d’eau. Recueillir au moins 2 L d’eau dans un contenant facile à verser de. Après que les détritus et les particules sont sont installés au fond du récipient, remplir doucement quelques petits contenants pour examiner pour Stentor, attendez quelques secondes après chaque collection pour les détritus pour s’installer dans le grand conteneur. Une fois terminée la collecte d’échantillons à un endroit, déplacer vers un nouvel emplacement qui est au moins 10 mètres et le prélèvement d’échantillons, il le répète.Remarque : Non chaque étang a une population de Stentor , ainsi que plusieurs étangs peuvent devoir être échantillonnés. Retour avec les échantillons au laboratoire et transférer de l’eau dans les conteneurs dans des boîtes de Pétri. Dans chaque boîte de Pétri, recherchez Stentor sous un stéréomicroscope avec lumière rasante au grossissement de X 5. Transfert des cellules individuelles de Stentor , à l’aide d’une pipette 1 mL dans un puits d’une plaque de verre spot contenant au moins 100 µL d’eau disponible dans le commerce pasteurisé (PSW).Remarque : Les cellules de Stentor ont une forme trompette lorsqu’ils sont attachés à un substrat (Figure 1). Les cellules de Stentor de natation sont moins étendues que celle des cellules attachés à un substrat (vidéo 1). Laver de Stentor dans PSW au moins 3 x. Effectuer les lavages en enlevant environ 90 % de l’eau du puits, tout en gardant les cellules de Stentor dans le puits, suivie d’ajouter 500 µL de PSW dans le puits.Remarque : Avant de manipuler de Stentor , à l’aide de pipettes avec des pointes de pipette de 10 µL ou plus petits, couper environ 0,5 mm de l’extrémité de l’embout de la pipette avec des ciseaux pour éviter de blesser les cellules à cause des forces de cisaillement qui sont générés comme une grande cellule traverse trop petite d’un op de pointe vation. Préparer Chlamydomonas avant chaque tétée de Stentor. Transférer 1 mL de la culture de Chlamydomonas préparée comme étape 1.1 dans un tube de microtubes de 1,5 mL. Centrifuger à 2 095 x g pendant 3 min. Retirez le surnageant et remis en suspension le culot dans 1 mL de PSW. Centrifuger à 2 095 x g pendant 3 min. Retirer le surnageant et Resuspendre le culot dans 500 µL de PSW.Remarque : Ainsi, lavé et concentré Chlamydomonas sera considérée comme une « préparé Chlamydomonas» dans les étapes suivantes. Médias de robinet est nuisible à Stentor, donc lavage Chlamydomonas avant que Stentor l’alimentation est importante. Si une culture de Stentor clonale est nécessaire, commencez la culture d’une cellule individuelle de Stentor ou un fragment de cellule. Étant donné que les cellules individuelles de Stentor ne poussent pas bien en PSW, préparer les milieux conditionnés par filtre stérilisant 500 µL de médias d’une culture de Stentor existante, en bonne santée. Transférer 500 µL de milieux conditionnés à un puits d’une plaque de verre de spot. Transférer un Stentor dans le puits de la plaque de verre spot contenant les milieux conditionnés. Utiliser comme moyen peu possible d’effectuer le transfert. Nourrir chaque µL de Stentor 5 de prêt Chlamydomonas toutes les 48 h. Lorsque Stentor divisez, compter le nombre de cellules dans le puits et ajouter 5 µL de prêt Chlamydomonas par cellule. Maintenez Stentor à l’ombre car les cellules sont sensibles à la lumière (par exemple, dans des boîtes en plastique transparent recouvert de serviettes en papier). L’échange moyen de Stentor dans le puits avec un milieu conditionné frais toutes les 96 h. Préparer les milieux conditionnés frais comme à l’étape 1.5.1. Faire toutes les cellules de Stentor de se détacher du fond du puits en pipettant doucement également le liquide monte et descend dans le puits. Soigneusement aspirer le liquide de la bien en utilisant une pipette 1 mL, en s’assurant que toutes les cellules restent dans le puits. Ajouter 500 µL de milieux conditionnés frais dans le puits. Lorsque le nombre de cellules dans le puits est supérieure à 20, déplacer les cellules vers un pot plus grand, par exemple, un pot de verre de large-bouche. Ajouter 20 mL de PSW dans un bocal en verre stérilisés à l’autoclave de large-bouche.Remarque : Autoclave de la verrerie de Stentor peut être remplacé par prudent de lavage et de rinçage. Soigneusement Pipetter médias monter et descendre dans le puits afin de détacher toutes les cellules du fond du puits. Collecter toutes les cellules de Stentor , à l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL et transférer doucement sur le bocal en verre. Ne pas serrer les couvercles sur les pots avec des cultures de Stentor , pour permettre un accès suffisant à l’air. Ajouter PSW dans le récipient toutes les 48 h pour maintenir la densité de Stentor à environ 20 cellules/mL. Estimer la densité des cellules de le œil.Note : Également utiliser une pipette de 1 mL à air bulle dans le bol pour fabriquer des cellules se détacher des parois, pipette de 1 ml de la culture et de compter le nombre de cellules dans l’embout de la pipette. Toutes les 48 h, aliments préparés Chlamydomonas à Stentor de cultures en pots (voir étape 1.4). Commencez par nourrir la culture avec 200 µL de prêt Chlamydomonas. Quand le volume de la culture augmente, graduellement augmenter le montant de prêt Chlamydomonas utilisé pour l’alimentation à 1 mL. Lorsque le volume de la culture a atteint environ 90 % de la capacité de la Jarre, transfert de la culture dans un pot plus grand. Pipetter la culture à l’intérieur du pot, de haut en bas, avec une pipette de 1 mL pour détacher le verre de Stentor . Versez tout le contenu du bol dans un récipient de 2 tasses. Rincer le bol environ 25 mL de PSW dans le récipient de 2 tasses pour recueillir les restants de Stentor. Maintenir les cultures saines dans des contenants de 2 tasses. Se nourrissent de Stentor cultures 2 mL de prêt Chlamydomonas par 100 mL de culture tous les 4-5 jours. Ajouter PSW pour le récipient en verre, toutes les 4-5 jours pour maintenir la densité de Stentor à environ 20 cellules/mL.Remarque : 450 mL est le volume maximum qu’est titulaire d’un récipient de 2 tasses. Une fois par semaine, inspecter les cultures sous une 5 X binoculaire pour les rotifères, les champignons et autre croissance. Pour prolonger la santé de la culture, supprimer des micro-organismes contaminants ainsi que les cellules anormalement en forme et sans couleur de Stentor à l’aide d’une pipette 1 mL. Lorsque le récipient en verre est environ 90 % de la pleine, diviser la culture. Ajouter 25 mL de PSW dans le récipient en verre. Utiliser une pipette à la pipette de 25 mL haut et en bas pour détacher le verre de Stentor . Déplacer environ 50 % de la culture dans un nouveau conteneur de 2 tasses. Ajouter 25 mL de PSW dans les deux cultures et continuer à maintenir les deux cultures comme décrit dans cette section du protocole.Remarque : Étant donné que les cellules de Stentor sont sensibles aux températures élevées, maintenir la température à 25 ° C ou plus bas dans la salle où les cultures sont conservées. Par ailleurs, les cultures peuvent être conservés dans un incubateur. Référer au tableau 1 pour le dépannage de culture de Stentor . 2. induisant la régénération de cellules de Stentor de coupe Utiliser un extracteur à aiguille pour faire plusieurs aiguilles des tubes capillaires en utilisant le programme comme suit : chaleur – 735, pull – 100, – 110, temps – 150, pression – 400. Préparer une solution de méthylcellulose 4 % dans 50 mL de PSW. Ajouter 1 g de méthylcellulose (viscosité : cP 1500) à 50 mL de PSW. Incuber à 4 ° C pendant au moins 8 h afin de faciliter la dissolution de méthylcellulose. Conserver 4 % méthylcellulose solution à température ambiante. Préparer une plaque de verre de place pour stocker les fragments de cellules après avoir effectué les découpes. Filtre stériliser les médias d’une culture saine, 500 mL par verre plaque spot bien nécessaire. Transférer 500 mL des médias stérilisé dans chacun des puits nécessaires. Recueillir une saine Stentor (ayant une forme de trompette définis, vibrant couleur bleu-vert et sans grandes vacuoles) dans une goutte de 2 µL et posez-le sur une lamelle couvre-objet ou de la diapositive. Ajouter 2 µL de méthylcellulose à 4 % (Figure 2). Laissez Stentor ralentir avant de couper (Video 2). Tenez l’aiguille de verre comme parallèle à la surface de coupe que possible pour empêcher que l’aiguille casse. À l’aide d’une chaîne stéréo binoculaire, recherchez la pointe de l’aiguille de verre et déplacez-le plus près à la cellule (Figure 3 a). Respecter le contrat de Stentor au contact avec l’aiguille (Figure 3 b et C).Remarque : Si la cellule est dans une orientation qui permet de séparer l’extrémité antérieure de l’extrémité postérieure difficile, tournez-le doucement le côté de l’aiguille. Appuyez doucement sur le contrat de Stentor avec la face de l’aiguille de verre pour couper la cellule en deux(Figure 3D et E, vidéo 3). Déplacez les deux fragments apart assurant qu’il n’y a aucun lien cytoplasmique entre eux, afin d’éviter la fusion du fragment (Figure 3F). Vérifier si les deux fragments ont au moins un nœud macronucléaire chaque en examinant les fragments sous un microscope à dissection avec éclairage oblique.Note : Ayant au moins un nœud macronucléaire est essentiel pour la survie des cellules. La cellule peut apporter sa pellicule (coque transparente) ainsi que le pigment bleu-vert, pendant ou après la coupe. Dans la plupart des cas, cela n’affectera pas la viabilité à long terme de la cellule. Déplacer les fragments dans des puits d’une plaque de verre spot préparé à l’étape 2.3. Couper plusieurs cellules parce qu’une fraction des cellules coupées ne régénérera pas. Si vous effectuez des coupes multiples en une seule séance, remplacer l’aiguille de verre lorsqu’elle est fortement recouverte avec des résidus de Stentor ou lorsque sa pointe est cassée. Vous pouvez également nettoyer l’aiguille en l’essuyant doucement sur un morceau de l’entretoise de silicium.Remarque : Aiguilles de verre peuvent être utilisés pour plusieurs sessions de découpage de cellule. Garder la plaque spot en verre avec des fragments de cellules dans une chambre humide. Passez à la Section 4 du protocole pour plus de détails sur l’imagerie et l’interprétation des résultats de la régénération de Stentor . 3. induisant la régénération des Membranellar bande et Oral appareil de saccharose ou de traitement de l’urée Membranellar band et oral enlèvement d’appareils à l’aide de saccharose Préparer une solution de 25 % de saccharose en PSW. Ajouter 500 µL de 25 % de sucrose dans PSW dans un tube de microcentrifuge avec un bouchon de pression. Préparer 3 tubes de microcentrifuge avec snap caps avec 1 mL de PSW dans chaque tube pour laver les cellules après traitement de saccharose. Prélever des cellules de Stentor de 30 à 60 dans 1 mL de leur milieux de culture dans un tube de microcentrifuge distinct à l’aide d’une pipette de 1 mL (Figure 4, flèche A). Collecter toutes les cellules du tube dans le volume final de 125 µL en utilisant une pipette µL 200 en un seul tirage au sort. Transférez-les sur le tube avec 500 µL de 25 % de sucrose (préparé à l’étape 3.1.2) pour obtenir 625 µL de solution de sucrose à 20 % (Figure 4, flèche B). Déclencher un chronomètre. Incuber Stentor dans cette solution de sucrose à 20 % et flick-spin le tube de microcentrifuge dans le panier pendant 1 min. Collecter toutes les cellules dans un seul tirage au sort (ajuster la pipette à capacité maximale de 200 µL de collection plus facile). Gardez les cellules à l’embout de la pipette jusqu’à ce que le chronomètre affiche 2 min de traitement de saccharose. Éjecter Stentor dans un des tubes de microcentrifuge préparées à l’étape 3.1.3 (Figure 4, flèche C). Flick-spin le tube dans le panier. Laver les cellules deux fois plus, une fois dans chacun des deux restant des microtubes à centrifuger contenant PSW préparées à l’étape 3.1.3 (Figure 4, flèches, D et E).Remarque : Tirage unique cellule collection technique n’est pas important entre les lavages. Passez à la Section 4 du protocole pour plus de détails sur l’imagerie et l’interprétation de la dynamique de la régénération Stentor (Figure 4, flèches, F et G). Membranellar band et oral enlèvement d’appareils à l’aide d’urée Préparer une solution d’urée de 4 % à PSW. Ajouter 300 µL de 4 % d’urée dans PSW dans un tube de microcentrifuge avec un bouchon de pression. Préparer 3 tubes de microcentrifuge avec snap caps contenant 1 mL de PSW dans chaque tube pour laver les cellules après le traitement de l’urée. Prélever des cellules de Stentor de 30 à 60 dans 1 mL de leur milieux de culture dans un tube de microcentrifuge distinct à l’aide d’une pipette de 1 mL (Figure 4, flèche A). Collecter toutes les cellules du tube dans le volume final de 300 µL à l’aide d’une pipette 1 mL en un seul tirage au sort. Transférez-les sur le tube avec 300 µL de 4 % d’urée (préparé à l’étape 3.2.2) pour obtenir 600 µL de solution de 2 % d’urée (Figure 4, flèche B). Déclencher un chronomètre. Incuber Stentor dans cette solution 2 % d’urée et flick-spin le tube de microcentrifuge dans le panier pendant 1 min. Collecter toutes les cellules dans un seul tirage au sort. Gardez les cellules à l’embout de la pipette jusqu’à ce que le chronomètre affiche 2 min de traitement de l’urée. Éjecter Stentor dans un des tubes de microcentrifuge préparées à l’étape 3.2.3 (Figure 4, flèche C). Flick-spin le tube dans le panier. Laver les cellules deux fois plus, une fois dans chacun des deux restant des microtubes à centrifuger contenant PSW préparées à l’étape 3.2.3 (Figure 4, flèches, D et E).Remarque : Tirage unique cellule collection technique n’est pas important entre les lavages. Passez à la Section 4 du protocole pour plus de détails sur l’imagerie et l’interprétation de la dynamique de la régénération Stentor (Figure 4, flèches, F et G). 4. imagerie et analyse de la régénération cellulaire Si à l’aide d’un microscope vertical, utilisez la pendaison méthode de gouttelettes à la régénération des cellules individuelles d’image. Mettre 100 µL de PSW dans un puits d’une plaque de verre de spot. Isoler 1 cellule de Stentor dans 4 µL de milieux de culture (les médias qu’ils ont), à l’aide d’un 10 ou 20 µL Pipeter. Déposer la goutte au milieu d’une lamelle de2 22 x 22 mm (Figure 5).Remarque : Si les cellules qui sont 1) malsain (anormalement en forme ou fortement vacuolisées) ou 2) conservent les bandes membranellar ou appareils oraux (pour des expériences de traitement chimique), ne pas utiliser pour l’imagerie. Organiser des gouttelettes plus 4 de Stentor dans les milieux de culture autour de la goutte précédente, tout en laissant suffisamment d’espace entre les gouttes. Inverser la lamelle couvre-objet avec des gouttelettes et placez-le délicatement sur le puits de la plaque de verre spot auxquelles PSW a été ajouté à l’étape 4.1. Remarque : PSW dans le puits réduira au minimum l’évaporation des gouttelettes (Figure 5). Préparer les cellules restantes pour l’imagerie en suivant les étapes 4.1.1 – 4.1.4. Les cellules régénératrices sous un microscope avec la résolution de la durée souhaitée de l’image. Vous pouvez également observer la régénération à l’aide d’un microscope stéréo à dissection.Remarque : La régénération commence immédiatement après la coupe de la cellule ou un traitement avec saccharose ou de l’urée. Cependant, des structures orales nouveau visibles formeront environ 3 h après le début de la régénération. Pour chaque point dans le temps, assignez l’une des trois phases de régénération à chacune des cellules. Pour ce faire, comparez chaque cellule pour les images représentatives illustrant les étapes (Figure 4 et Figure 6). Attribuer 1 stade aux cellules qui n’ont pas encore une bande de membranellar (Figure 6 a). Assigner étape 2 pour les cellules avec une bande de membranellar.Remarque : Il apparaît une bande de membranellar 3-6 h après le traitement (Figure 4, Figure 6 b). À la fin de cette étape, une courbure supplémentaire de l’extrémité postérieure de la bande de membranellar s’affiche juste avant un oral primordium apparaît. Assigner étape 3 pour les cellules avec un primordium par voie orale.Remarque : Un primordium orale est une invagination apparaissant 6 à 8 heures après le traitement à l’extrémité postérieure de la bande de membranellar (Figure 4, Figure 6 et 6 D). La régénération est terminée lorsque les cellules ont une bande de membranellar à leur extrémité antérieure et la forme des cellules trompette caractéristique (Figure 4, 6E de la Figure). La plupart des cellules de Stentor sont entièrement régénérés dans les 8 et 9 h depuis le début de la régénération. Tracer le pourcentage de cellules dans chacune de ces étapes de régénération pour chaque point de temps sous la forme d’un empilement boîte à moustaches (Figure 7).Remarque : Ce type de tracé permet la visualisation de la dynamique de la régénération dans une population de cellules.