أساليب لدراسة التجديد في ستنتور
Summary
سيلياتي العملاقة، كوروليس ستنتور، نظام ممتاز لدراسة تجديد والتئام الجروح. نقدم الإجراءات لإنشاء ستنتور الثقافات الخلية من الخلايا المفردة أو أجزاء الخلية، وحفز التجدد بقطع الخلايا، كيميائيا حفز التجديد للفرقة ميمبرانيلار والجهاز عن طريق الفم، والتصوير، وتحليل للخلية التجديد.
Abstract
الخلايا بحاجة إلى أن تكون قادرة على تجديد أجزائها على التعافي من الاضطرابات الخارجية. سيلياتي أحادي الخلية كوروليس ستنتور هو الكائن نموذجا ممتازا لدراسة التئام الجروح وتجديد الخلايا اللاحقة. أن الجينوم ستنتور أصبح متاحاً في الآونة الأخيرة، جنبا إلى جنب مع طرق البيولوجيا الجزيئية الحديثة، مثل [رني]. هذه الأدوات تجعل من الممكن لدراسة تجديد خلية واحدة على المستوى الجزيئي. ويغطي الجزء الأول من البروتوكول ستنتور إنشاء خلية الثقافات من الخلايا المفردة أو أجزاء الخلية، جنبا إلى جنب مع المبادئ التوجيهية العامة للحفاظ على الثقافات ستنتور . استزراع ستنتور بكميات كبيرة تسمح باستخدام أدوات قيمة مثل الكيمياء الحيوية، وتسلسلها، والطيف الكتلي. وتغطي الأجزاء اللاحقة من البروتوكول نهج مختلفة لحفز التجدد في ستنتور. قص الخلايا يدوياً بإبرة زجاجية تسمح دراسة تجديد أجزاء الخلية الكبيرة، بينما علاج الخلايا مع السكروز أو اليوريا يسمح لدراسة تجديد هياكل محددة تقع في نهاية الأمامي للخلية. يتم توفير طريقة لتصوير الخلايا تجديد الفردية، جنبا إلى جنب مع شعار التدريج وتحليل ديناميات التجديد. وتنقسم العملية برمتها من التجدد في ثلاث مراحل. بتصور ديناميات تطور عدد سكان خلايا عبر المراحل، يتضح عدم التجانس في توقيت التجدد.
Introduction
الخلايا غير أكياس بسيطة من الإنزيمات، ولكن آلات معقدة للغاية بدلاً من عناصرها يتم تحجيمها إلى الحجم الصحيح بعناية ومرتبة في مواقف محددة تحديداً جيدا. Morphogenesis الخلايا الفردية يمثل عملية رئيسية في الخلية وعلم الأحياء التنموي، لكن آليتها الجزيئية غير معروف1،2. في حين تشبه بعض الخلايا المستزرعة النقط، الكائنات الحية أحادي الخلية يمكن أن يكون معقداً للغاية أبنية، يتجلى في أنماط معقدة القشرية ينظر في سيلياتيس3،4.
ربما هو المثال الأكثر تطرفاً لخلية التنظيم كويروليوس ستنتور، بعيد تتصل هيتيروتريتشوس عملاقة سيلياتي تيتراهيمينا و براميسيوم. ستنتور 1 مم طويل ومغطى بشرائط طولية أكثر من 100 من صبغة زرقاء بالتناوب مع صفوف من أهداب تنظمها المكدسات المتوازية من شرائط ميكروتوبولي التي تعمل طول الخلية بأكملها. الخلية البوق-يتشكل (الشكل 1)، مع عصابة ميمبرانيلار وجهاز عن طريق الفم (الزراعة العضوية) في نهايته الأمامية، وهولدفاست التي تعلق الخلية إلى الركيزة في نهايته الخلفية. الخلية بالإضافة إلى قطبية واضحة الأمامي الخلفي، كما يبين الزخرفة مراوان مميزة، مثل أن التباعد بين صفوف الهدبية تدريجيا الزيادات في اتجاه عقارب الساعة. ينتج عن هذا انقطاع حيث يجتمع الصف أضيق الصف أوسع، وهذه المنطقة من سطح الخلية، المعروفة باسم محور التباين شريطية، يمكن أن يؤدي إلى تشكيل المجموعة الثانية من هياكل نهاية الأمامي عند المطعمة على آخر خلية5، مما يعادل رسميا منظم سبيمان. وهكذا، يكون جميع العمليات الرئيسية لعلم الأحياء التنموي على النظير في ستنتور: أكسياتيون وتشكيل نمط التعريفي. في جنين، هذه العمليات هي مدفوعة بمصير الاختلافات بين خلايا مختلفة، ولكن في ستنتور، وأنهم يجب أن يكون مدفوعا بمصير الفروق بين المناطق المختلفة داخل خلية واحدة. ما يحدد الاختلافات بين المناطق داخل ستنتور لغزا.
إذا تم اقتطاع أي جزء من ستنتور ، يمكن تجديد القطعة المفقودة من الخلية تسفر عن خلية عادية في غضون ساعات. إذا كانت خلية قطع في نصف، أو حتى إلى قطع أصغر بكثير، كل قطعة يعيد إلى خلية يبحث عادي ولكن أصغر حجماً ويعيد التناسب الصحيح بين خلية أجزاء6،7. أجزاء صغيرة حتى، 1/64th حجم الخلية الأصلية، وقادرة على التجدد في زنزانة صغيرة ولكنها تتناسب عادة ومن ثم تنمو إلى الحجم الكامل6. ستنتور وبالتالي من فرصة فريدة لدراسة آليات عضية الحجم التحجيم خلية نمو التنظيم واستخدام الطرق الجراحية التي تطبق عادة على مستوى الأنسجة أو الكائنات الحية كلها.
واحدة من خصائص ستنتور التي يسمح لها بتجديد من طائفة واسعة من العمليات الجراحية يحتوي ماكرونوكليوس نودولاتيد واحد (الشكل 1) مع حوالي 50 ألف نسخة ل الجينوم الكامل8. ما دام جزء من خلية تحتوي على عقده واحدة على الأقل ماكرونوكلير، لديها القدرة على تجديد تماما. خاصية أخرى الكامنة وراء قدرة التجدد ستنتورهو قدرته المذهلة التئام الجروح. وعلى الرغم من العديد من أنواع الخلايا قادرة على شفاء الجروح على9، ستنتور قادراً على استرداد من مجموعة غير عادية من الاضطرابات الجسدية. وأفيد سابقا مثالاً لاسترداد ستنتور من اضطراب جذري، جنبا إلى جنب مع الأساليب لتصور تدفق هيولى في ستنتور10 . تسمح هذه الطرق دراسة كيفية إصابة واللاحقة تؤثر تجديد الحالة المادية السيتوبلازم.
ستنتورضخمة الحجم والقدرة على التجديد غير عادية، وحقيقة أن ذلك يظهر العديد من الظواهر الإنمائية التي ينظر في أجنة متعددة الخلايا (مثل المنظمين، أكسياتيون، والزخرفة) اجتذبت العديد من علماء الأحياء التنموي خلال مطلع القرن الماضي، بما في ذلك “توماس هانت مورغان”7. خلال 50 عاماً وال 60، أثبت النهج microsurgical مجموعة مذهلة من عمليات التجدد ومورفوجينيتيك في هذا الحي وحيدة11. ومع ذلك، ستنتور قد وضعت كنظام نموذجي لبيولوجيا الجزيئية إلا في الآونة الأخيرة. خلال السنوات القليلة الماضية، كان تسلسل جينوم ستنتور وجمعت8، وكان الأسلوب للتشويش التعبير الجيني باستخدام [رني] عن طريق تغذية المتقدمة12.
وكان أحد الأسباب أن ستنتور قد تطورت إلى كائن نموذج للبيولوجيا الجزيئية الحديثة فقط مؤخرا صعوبة متزايدة الثقافات الكبيرة نظراً لدورة الخلية طويلة (3 إلى 5 أيام). ومع ذلك، تتطلب أساليب الجينوم والبروتين الحديثة المواد أقل مما كانوا، وحجم خلية ستنتور واحدة كافية لهذه الأساليب، حتى بدون اللجوء إلى أساليب أولتراسينسيتيفي التي تم تطويرها لتحليل واحد الخلايا التي أصغر بكثير من ستنتور. المادة 1 من البروتوكول تفاصيل الإجراءات المتعلقة بإرساء ثقافة كبيرة من خلية واحدة ستنتور . يمكن استخدام نفس النهج لإرساء ثقافة كبيرة من جزء خلية التي تم الحصول عليها عن طريق خفض خلية. كما يقدم الفرع 1 المبادئ التوجيهية للحفاظ على صحة ستنتور الثقافات على مدى فترات طويلة من الزمن. تنص المادة 2 من البروتوكول المنهجية لحفز التجدد الخليوي بقطع الخلايا يدوياً بإبرة زجاج. المادة 3 من البروتوكول مكرس لطريقتين لحفز تجديد هياكل خلية معينة (جهاز ميمبرانيلار الفرقة والفم): علاج الخلايا مع السكروز أو اليوريا يؤدي إلى سفك هذه الهياكل، تليها بهم التجديد. المادة 4 من البروتوكول تفاصيل طريقة لتصوير الخلايا تجديد الفردية على مدى فترات طويلة من الزمن. وينتهي القسم 4 مع وصف مراحل التجديد ونصائح حول تحليل ديناميات التجديد.
Protocol
Representative Results
Discussion
استزراع ستنتور يعرض عددا من التحديات. أولاً، لإجراء التجارب التي تتطلب أعدادا كبيرة من الخلايا، يحتاج المرء الإبقاء على عدد كبير من الثقافات ستنتور ، كثقافات تصبح غير صحية عندما يتجاوز تركيز ستنتور 20 خلايا/مل. ثانيا، الكائنات الحية التي يمكن أن تلوث الثقافات ستنتور غالباً ما تقسم أسرع من ستنتور وتطغى الثقافة (وهو الملوثات شائعة الروتيفر). وبالتالي، من الضروري أن تفقد الثقافة تحت مجهر بشكل دوري وإزالة الملوثات. في بعض الأحيان، يحتاج ثقافة جديدة ليبدأ من عدد صغير من الخلايا التي أنقذت يدوياً من ثقافة ملوثة. وهذا يزيد من الوقت اللازم للمحافظة على صحة جيدة ستنتور الثقافات. ثالثا، توسيع خلية واحدة إلى ثقافة 400 مل يتطلب شهر واحد على الأقل لدورة الخلية ستنتور من 3-5 أيام. رابعا، خلافا للنموذج الآخر سيلياتيس، ستنتور نادراً ما تذهب إلى شكل كيسه وأنهم لا يمكن أن تجمد.
جانبا مهما من استزراع ستنتور هو اختيار كائن حي الغذاء المناسب. أساليب مختلفة لاستزراع ستنتور وصفت سابقا. واحد منهم يقترح استخدام اللبن المقشود للبكتيريا الثقافة التي تغذي ثم ستنتور. هذه تقنية فعالة في استزراع ستنتور؛ ومع ذلك، يتطلب تطبيق تقنيات الجينوم عينات نقية لتجنب الارتباك الناجم عن قراءة الجينوم من الكائنات الحية الغذاء غير معروف. استخدام البروتوكول الحالي، يمكن زراعتها ستنتور في الكتلة و، لأنه قد تم تعيين تسلسل طعامهم، تشلاميدوموناس،، يمكن الكشف عن وجود تلوث الجينوم من الكائنات الحية الغذاء وتسيطر عليها. لأسباب غير معروفة، كان التكلس تجديد المخزونات له بالعودة إلى حيث وجد ستنتور قبل. مع البروتوكول الحالي، وقد تمكنا من إبقاء ستنتور لسنوات.
تجارب التجديد مع ستنتور واضحة عموما، ولكن هناك بعض التفاصيل الهامة نضع في اعتبارنا. وفيما يتعلق بالمادة 2، قطع ستنتور يمكن أن يتقن الخلايا في نصف دقيقة. وقد يتطلب إتقان إجراءات الجراحة أكثر تقدما من ستنتور أسبوع ممارسة. وفي حين أداء علاج السكروز أو اليوريا (الجزء 3)، إذا في بداية تصوير معظم الخلايا لا تزال تلك العصابات ميمبرانيلار، زيادة وقت الحضانة من 10-30 ثانية لعندما يتم تنفيذ المعاملة السكروز التالية. لا تزيد وقت المعاملة السكروز خارج الحضانة 3 دقيقة نظراً لأنه سوف يؤدي إلى موت الخلية.
التصوير من ستنتور يتطلب تجديد الأساليب بصورة كبيرة الخلايا على مدى فترات طويلة من الزمن. يمكن استخدام أسلوب التصوير بالتفصيل في القسم 4 فقط مع مجهر تستقيم. ثم إذا كان متوفراً مجهر مقلوب بدلاً من ذلك، يمكن وضع الخلايا على الشريحة أو ساترة في الدوائر الصغيرة. أسلوب واحد إنشاء دائرة من فازلين وتغطي مع آخر ساترة لمنع التبخر. وبدلاً من ذلك، يمكن إجراء دائرة لخلية مفردة بصنع حفرة لكمه ثقب من الحجم المطلوب في 1 × 1 سم2 مربعة من مباعدة السيليكون (الجدول للمواد)، وضع فاصل على ساترة، ووضع الخلايا في قاعة ، والتي تغطي الدائرة مع ساترة آخر. عند التصوير، وإذا لم ستنتور في الاتجاه الصحيح مراعاة السمات المميزة لكل مرحلة من التجدد، اضغط على لوحة بحزم لجعل العقد من الخلية. مشاهدة الخلية تمتد إلى تحديد مرحلة التجديد (ملحق كامل يأخذ حوالي 45 ثانية). إذا كانت الخلية لا تزال في اتجاه خاطئ، كرر التنصت. واتخذت هذه الصور هو مبين في الشكل 1 و الشكل 6 مجهر تكبير ستيريو؛ ومع ذلك، يمكن إجراء جميع التجارب بالتفصيل استخدام 5 × تشريح مجهر ستيريو.
يتمثل التحدي الآخر إلى جانب استزراع والتصوير ستنتور تتبع للتجديد، على وجه التحديد مقدار الوقت اللازم التعرف على مراحل. إذا كانت الخلية تجديد المنحى تماما مع منطقة بريمورديوم الشفوية واضحة للعيان، تحديد المرحلة التي تستغرق بضع ثوان. في بعض الأحيان، ومع ذلك، الخلية ستنتور في اتجاه الحيلولة دون تحديد واضح لمرحلة التجديد، ومن ثم أخذ مزيد من الوقت لتحديد. القدر الكبير من الوقت المطلوب لمرحلة الخلايا تجديد الفردية قد يؤخر التقدير الكمي للخلايا تجديد كافة، وبالتالي تقليل الدقة الزمنية التدريج والتي تتطلب المراقب الانتظار وإعادة الصورة الخلية بعد ذلك انتقل إلى توجه جديد. ونتيجة لذلك، هي هذه التجربة المرة وكثيفة العمالة. لهذه الأسباب، سيكون من المرغوب فيه جداً لتطوير أساليب مؤتمتة للكشف عن الخلايا ستنتور وتعيين مراحل التجديد في بيانات الفيديو مجهرية. هذه سوف تسمح أيضا لمزيد من التجارب استنساخه، زيادة في حجم العينة، وإزالة التحيز القائم على البشرية.
قد بدأ ظهور أساليب الجينوم والبروتين حساسة للغاية لوضع دراسات للخلايا المفردة في الوصول. لمثل هذه التحليلات خلية واحدة، يجعل حجم خلية ستنتور العملاقة موضوع اختبار المرغوب فيه لتجارب إثبات المفهوم. لهذه التجارب وذلك يكون من الممكن، استزراع ستنتور هو أمر أساسي، ومن ذلك الأساليب الموصوفة هنا ينبغي أن تلعب دوراً في زيادة تطوير تقنيات أكثر تقدما من خلية واحدة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أيد هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة المنحة R01 GM113602 (الحركة) وجبهة الخلاص الوطني 1144247 (AL). ونعترف سلابودنيك مارك وناتالي كيركلاند لتطوير الإصدارات الأولية من بعض من هذه البروتوكولات ومناقشات غنية بالمعلومات. ونحن نشكر بيرلازا كارينا ولويس غريسون لقراءة نقدية من المخطوطة.
Materials
| Stentor coeruleus live culture | Carolina Biological Supply | 131598 | |
| Chlamydomonas reinhardtii on agar | Carolina Biological Supply | 152040 | |
| Pasteurized springwater, 1-quart bottle | Carolina Biological Supply | 132458 | |
| Methyl cellulose, 1500 cP | Millipore Sigma | M0387 | |
| Pyrex glass spot plate | Fisher Scientific | 13748B | |
| Wide-mouth glass jar with screw cap, 60 mL | Carolina Biological Supply | 715740 | |
| 2-cup glass container with glass lid | Pyrex | 1095600 | |
| CultureWell silicone sheet material | Grace Bio Labs | 664475 | |
| Kimwipes | Kimberly Clark | 34155 | |
| Posi-Click 1.7 mL microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| Cover Glass | Fisher finest | 12-548-B | |
| TAP Growth Media, optimized for Chlamydomonas culture | ThermoFisher | A1379801 | |
| Silicone spacer, CultureWell Silicone Sheet, 0.25mm Thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio Labs | 664475 | |
| Petrolatum, Petroleum Jelly, White | Spectrum | P1037 | |
| Borosilicate glass capillary tubes. OD: 1.2 mm, ID: 0.9 mm, length: 10 cm. |
Sutter Instrument | B120-90-10 | |
| Needle puller P-87 | Sutter Instrument | ||
| Stemi 2000 stereo microscope | Zeiss | ||
| Axiozoom V16, stereo zoom microscope | Zeiss |
References
- Kirschner, M., Gerhart, J., Mitchison, T. Molecular “vitalism”. Cell. 100 (1), 79-88 (2000).
- Shulman, J. M., St Johnston, D. Pattern formation in single cells. Trends in Cell Biology. 9 (12), M60-M64 (1999).
- Wloga, D., Frankel, J. From molecules to morphology: cellular organization of Tetrahymena thermophila. Methods in Cell Biology. 109, 83-140 (2012).
- Frankel, J. . Pattern Formation: Ciliate Studies and Models. , (1989).
- Tartar, V. Grafting experiments concerning primordium formation in Stentor coeruleus. Journal of Experimental Zoology Part A. 131 (1), 75-121 (1956).
- Lillie, F. R. On the smallest parts of Stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter. Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).
- Morgan, T. H. Regeneration of proportionate structures in Stentor. The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).
- Slabodnick, M. M., et al. The macronuclear genome of Stentor coeruleus reveals tiny introns in a giant cell. Current Biology. 27 (4), 569-575 (2017).
- Tang, S. K. Y., Marshall, W. F. Self-repairing cells: How single cells heal membrane ruptures and restore lost structures. Science. 356 (6342), 1022-1025 (2017).
- Slabodnick, M., Prevo, B., Gross, P., Sheung, J., Marshall, W. Visualizing cytoplasmic flow during single-cell wound healing in Stentor coeruleus. Journal of Visualized Experiments. 82 (82), 50848 (2013).
- Tartar, V. . Biology of Stentor. , (1961).
- Slabodnick, M. M., et al. The kinase regulator mob1 acts as a patterning protein for stentor morphogenesis. PLOS Biology. 12 (5), e1001861 (2014).
- Harris, E. . The Chlamydomonas sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and its laboratory use. 1, (2009).
