إعداد والسليكا الوظيفية باستخدام أسلوب بيوينسبيريد
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لتوليف مواد السيليكا بيوينسبيريد وشل الإنزيمات فيه. يتم تصنيعه السليكا بالجمع بين سيليكات الصوديوم، وأمين ‘مضافة’، تحييد بمعدل الخاضعة للرقابة. ويمكن تغيير خصائص المواد ودالة في الموقع تجميد إنزيم أو الاصطناعية بعد شطف حمض المضافات الغذائية المغلفة.
Abstract
وهدف البروتوكولات المبينة في هذا التقرير هو توليف مواد السيليكا بيوينسبيريد وأداء التغليف إنزيم فيه جزئيا أو كلياً تنقية نفسه من شطف حمض. عن طريق الجمع بين سيليكات الصوديوم مع بيوينسبيريد بوليفونكشونال مضافة، والسليكا تتشكل سريعاً في الظروف المحيطة على تحييد.
يجري التحقيق في تأثير تحييد معدل وبيوموليكولي إضافة نقطة على السليكا الغلة، وذكر كفاءة التثبيت بيوموليكولي لاختلاف إضافة نقطة. على النقيض من أساليب أخرى في توليف والسليكا المسامية، يرد أن معتدل الشروط المطلوبة لتوليف السليكا بيوينسبيريد متوافقة تماما مع تغليف الجزيئات الحيوية الحساسة. بالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام شروط معتدلة عبر كافة الخطوات التوليف والتعديل، مما يجعل السليكا بيوينسبيريد هدفا واعدة للارتقاء وتسويق المواد العارية والمتوسطة الدعم النشط.
ويرد التقرير التوليفي لتكون حساسة للغاية للظروف، أي معدل الأبطال والحموضة التجميع النهائي، ولكن ضيق والسيطرة على هذه المعلمات يتجلى من خلال استخدام أساليب المعايرة التلقائية، مما يؤدي إلى إمكانية تكرار نتائج عالية في مسار تطور رد الفعل والغلة.
ولذلك، السليكا بيوينسبيريد خيار دعم مادي نشط ممتازة، إظهار مرونة تجاه العديد من التطبيقات الحالية، لا تقتصر على تلك التي أثبت هنا، والفاعلية في التطبيقات المستقبلية.
Introduction
استخدام السليكا كدعم هيكلية للمحفزات الصناعية راسخة، مما يسمح لنشاط محفز محسنة والاستقرار والتجهيز،1 ومن ثم يحتمل أن تخفيض تكاليف التشغيل. وتتفاقم هذه الفوائد في حالة تجميد إنزيم، كالتخزين داخل نظام مسام والسليكا يمكن أن تمنح فوائد كبيرة على عمر الإنزيم على نظيرتها الحرة. وبناء على ذلك، أنفق الكثير من الجهد في العثور على أفضل طريقة لإرفاق الإنزيمات للأنواع والسليكا، مع ملاحظات متعددة مقارنة التحقيقات باستخدام أساليب مختلفة للتثبيت على وملاط يدعم الصلبة. 2 , 3 , 4
عادة ما يتم إرفاق الإنزيمات عبر فيسيسوربشن أو الترابط التساهمي، بالإضافة إلى تغليف داخل مادة مسامية. 5 ومع ذلك، هناك عيوب كبيرة تتصل بكل أسلوب: فيسيسوربشن يعتمد على التفاعلات السطحية العابرة بين والسليكا وبيوموليكولي، التي يمكن أن تضعف بسهولة جداً برد فعل الظروف المؤدية إلى ما لا يمكن قبوله إنزيم النض. عادة ما ينتج كثير المرفق التساهمية أقوى نشاط أقل بسبب حرية conformational انخفاض الأنواع النشطة. يمكن أن يؤدي انخفاض النشاط بسبب صعوبة الوصول إلى إنزيم أو قيود ديفوسيونال التغليف. 6
التطورات الأخيرة في المجال أكثر اعتدالا من التوليفات السليكا (غالباً ما يطلق عليها اسم ‘بيوينسبيريد’) أقامت التغليف في الموقع من الجزيئات الحيوية وغيرها من الأنواع النشطة خلال التوليف المادية. 7 , 8 , 9 يبطل هذا الأسلوب العديد من المآخذ على التثبيت التقليدية–خلافا للنهج chemisorption هو الإبقاء على حرية كونفورماشونال بيوموليكولي باستخدام التفاعلات نونكوفالينت الأضعف ولكن كأشكال تجويف المسام حولها بيوموليكولي، ما زالت تمنع النض. وفي الواقع، التغليف وقد ثبت للعمل لمجموعة من الجزيئات الحيوية وحتى كل الخلايا،10 ويمكن تجنبها عن طريق التغليف في بيوينسبيريد والسليكا تأثيرات مثل التعطيل بسبب عملية قاسية الظروف. 7 , 11
هدف الطريقة الموصوفة هنا إعداد السليكا المليئة بالثغرات مع خصائص يمكن السيطرة عليها، في ظل الظروف المحيطة، باستخدام المواد عضوية مضافة على بيوينسبيريد. يمكن بسهولة تعديل الأسلوب لتشمل تغليف الجزيئات غير العضوية أو بيورجانيك، مجموعة مختارة من الذي يوضع. ونحن كذلك إظهار طريقة سهلة لتعديل المواد التي جمعت كتحقيق خصائص السائبة المرجوة وتنقية بإزالة القالب العضوية عن طريق شطف حمض.
مقارنة بتوليف التقليدية ليدعم templated والسليكا المسامية (مثلاً،والسليكا مواد موجودة في قالب من خلال الجمعيات الفاعل supramolecular مثل 41 مليون متر مكعب أو سباعي-15)12 هذا الأسلوب إلى حد كبير أسرع وأكثر اعتدالا، تمكين مصممة، التغليف في الموقع دون الحاجة للعديد من خطوات التثبيت وتنقية شاقة. وعلاوة على ذلك، استخدام شطف حمض بدلاً من تكليس يفتح إمكانية العضوية الروغان السطحية.
هذا الأسلوب الغاية تنطبق على أولئك الذين يعملون في تجميد الأنواع النشطة الذين وجدوا فيسيسوربشن أو تجميد التساهمية غير فعالة. كما أنها مفيدة للبحث في عملية الارتقاء بحسب التوليف بيوينسبيريد في موقف فريد للتصنيع بالمقارنة مع المواد التقليدية والسليكا templated. 13 , 14 لا ينصح بهذا الأسلوب للتطبيقات التي تتطلب مجموعة مرتبة من مسام داخل المواد مثلاً،والضوئيات، كبنية مادية هو اضطرابه رغم أي تشابه في خصائص السائبة.
Protocol
Representative Results
Discussion
في العمل الحالي، نقدم طريقة لسرعة عجل بيوينسبيريد والسليكا المواد وتغليف الجزيئات الحيوية فيه. علينا أن نظهر الخطوات الحاسمة ضمن الإجراء، إلا وهي كمية حمض الشروع في رد فعل لإضافتها، وتوقيت إضافة انكابسولانت بيوموليكولي. نظهر أثر إضافة حمض المبلغ على تطور رد الفعل والعائد (الشكل 4 و الشكل 5، على التوالي)، وأظهر أسلوب لرقابة مشددة على شروط التوليف، مما يسمح للاتساق وعلى الرغم من هذه الحساسية. فيما يتعلق بتغليف الأنواع النشطة، رغم مباشرة من حيث الإجراء، تغليف يرد ينبغي أن تراعي ظروف التجربة (ترتيب الإضافة، درجة حموضة إضافة، الظروف البيئية)، ومع ذلك، الاتساق في المواد مرة أخرى من خصائص قابلة للتحقيق.
يمكن تعديل شروط التوليف من خلال استخدام المضافات المختلفة، قد نشرت العديد منها في أماكن أخرى،15 تقديم مجموعة من مورفولوجيس ومساميه. وأبلغ تقنيات أخرى، بعد انتهاء الاصطناعية تعديل وتكييف مواد السيليكا بيوينسبيريد كيميائيا مثل تنقية خفيفة13 وسطح الديكور أمين. 20 أخيرا، نظراً لطبيعة تركيب خفيفة، مائي، التغليف في الموقع من الممكن لنطاق أوسع من ركائز من تلك أثبت هنا، بدءاً من الإنزيمات17،18 لكل الخلايا،21 المعادن الأملاح،22 المكونات الصيدلانية الفعالة، النقاط23 والكم. 24
خلافا لغيرها التوليفات العضوية بوساطة السليكا (مثل عائلة المواد 41 مليون متر مكعب أو سباعي-15)، طبيعة بوليفونكشونال بيوينسبيريد لا يمكن أن تنتج المواد المضافة أمرت هياكل المسامية، ولا شدة مونوديسبيرسي توزيع حجم الجسيمات خاصية من نوع Stöber والسليكا. 25 نظراً لعدم وجود سلوك ميسيليزيشن واضحة المعالم من المضافات (خارج الحالات الخاصة) بيوينسبيريد26 يقترن ذلك بنشاطها التحفيزي زيادة على الإضافات المحتوية على أمين مونوفونكشونال. 26
من ناحية أخرى، تمكن هذه الطبيعة المضافة بوليفونكشونال استخدام أقصر رد فعل مرات وأكثر اعتدالا درجة الحرارة والضغط مقارنة بغيرها التوليفات والسليكا العضوية بوساطة. يؤدي هذا أيضا إلى إمكانية شطف المضافة درجة حرارة الغرفة كما هو موضح أعلاه، الذي لم يتحقق لهذه والسليكا الأسر الأخرى نظراً لخصوصيات هذه الكيمياء السطحية. 27 , 28 , 29 وبالتالي مواد السيليكا بيوينسبيريد أظهرت أن تكون أكثر اقتصادا والعملية لإنتاج على نطاق أوسع، مما يؤدي إلى تسويق أسهل والتنمية. 14
وباختصار، يمثل بيوينسبيريد والسليكا توليف طريقة سريعة وسهلة لإنتاج يدعم الأنواع النشطة أو غاز مسيل وسائط الإعلام. من خلال رقابة صارمة من درجة الحموضة أثناء وبعد التفاعل، مجموعة واسعة من مركبات السليكا-أمين يمكن توليفها مع خصائص مختلفة، التي تكملها كذلك إمكانية في الموقع تغليف طائفة واسعة من مختلف العضوية، المواد غير العضوية أو البيولوجية العضوية. على الرغم من أن التعديل بعد الاصطناعية المستقلة بيوينسبيريد المضافة وتركيز انكابسولانت لم يتحقق، وهذه الأساليب تمثل خطوة واعدة نحو العمليات الكيميائية غير ضارة بيئياً.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون دعم مالي من إدارة الكيماويات والهندسة البيولوجية (جامعة شيفيلد) و EPSRC (الجيش الشعبي/L017059/1 والجيش الشعبي/P006892/1).
Materials
| Silica synthesis | |||
| Sodium silicate pentahydrate | Fisher scientific | 10070470 | |
| Pentaethylene hexamine (PEHA) | Sigma-Aldrich | 292753 | |
| Diethylenetriamine (DETA) | Sigma-Aldrich | D93856 | Toxic |
| Triethylenetetraamine (TETA) | Sigma-Aldrich | 90460 | |
| Poly(ethyleneimine) (PEI) | Polysciences | 6088 | 1.2K MW |
| Poly(allylamine hydrochloride) (PAH) | Sigma-Aldrich | 283215 | 17.5k MW |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Hydrochloric acid (HCl) 1M | Fisher Scientific | 10487830 | |
| Silicomolybdic acid assay | |||
| Ammonium molybdate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | A7302 | Product replaced by M1019 |
| Hydrochloric acid (HCl) 37.0%wt | Fluka Analytical | 84436 | |
| Anhydrous oxalic acid | Sigma-Aldrich | 75688 | |
| Para-aminophenol sulphate | Fisher Scientific | 10446880 | |
| Sodium sulphite | Fisher Scientific | 10234400 | |
| Sulphuric acid | Sigma-Aldrich | 84727 | |
| Bradford assay | |||
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | |
| Equipment | |||
| Autotitrator Titrando 902 | Metrohm | 2.902.0010 | |
| 801 magnetic stirrer plate | Metrohm | 2.801.0040 | For use with above |
| 800 Dosino | Metrohm | 2.800.0010 | For use with above |
| Aquatrode Plus | Metrohm | 6.0253.100 | For use with above |
| Centrifuge Sorvall ST16 | Thermo Scientific | 11814243 | Code is for Fisher scientific |
| UV-Vis spectrophotometer Genesys 10A | Thermo scientific | 12104972 | Code is for Fisher scientific |
References
- Swaisgood, H. E. The use of immobilized enzymes to improve functionality. Proteins Food Process. , 607-630 (2004).
- Hartmann, M., Kostrov, X. Immobilization of enzymes on porous silicas – benefits and challenges. Chem Soc Rev. 42 (15), 6277 (2013).
- Hudson, S., Cooney, J., Magner, E. Proteins in Mesoporous Silicates. Angew Chemie Int Ed. 47 (45), 8582-8594 (2008).
- Hanefeld, U., Gardossi, L., Magner, E. Understanding enzyme immobilisation. Chem Soc Rev. 38 (2), 453-468 (2009).
- Magner, E. Immobilisation of enzymes on mesoporous silicate materials. Chem Soc Rev. 42 (15), 6213-6222 (2013).
- Rodrigues, R. C., Ortiz, C., Berenguer-Murcia, &. #. 1. 9. 3. ;., Torres, R., Fernández-Lafuente, R. Modifying enzyme activity and selectivity by immobilization. Chem Soc Rev. 42 (15), 6290-6307 (2013).
- Forsyth, C., Patwardhan, S. V. . Bio-Inspired Silicon-Based Materials. 5, (2014).
- Luckarift, H. R., Spain, J. C., Naik, R. R., Stone, M. O. Enzyme immobilization in a biomimetic silica support. Nat Biotechnol. 22 (2), 211-213 (2004).
- Betancor, L., Luckarift, H. R. Bioinspired enzyme encapsulation for biocatalysis. Trends Biotechnol. 26 (10), 566-572 (2008).
- Livage, J., Coradin, T., Roux, C. Encapsulation of biomolecules in silica gels. J Phys Condens Matter. 13 (33), R673-R691 (2001).
- Hartmann, M., Jung, D. Biocatalysis with enzymes immobilized on mesoporous hosts: the status quo and future trends. J Mater Chem. 20 (5), 844 (2010).
- Carlsson, N., Gustafsson, H., Thörn, C., Olsson, L., Holmberg, K., Åkerman, B. Enzymes immobilized in mesoporous silica: A physical-chemical perspective. Adv Colloid Interface Sci. 205, 339-360 (2014).
- Manning, J. R. H., Yip, T. W. S., Centi, A., Jorge, M., Patwardhan, S. V. An Eco-Friendly, Tunable and Scalable Method for Producing Porous Functional Nanomaterials Designed Using Molecular Interactions. ChemSusChem. 10 (8), 1683-1691 (2017).
- Drummond, C., McCann, R., Patwardhan, S. V. A feasibility study of the biologically inspired green manufacturing of precipitated silica. Chem Eng J. 244, 483-492 (2014).
- Patwardhan, S. V. Biomimetic and bioinspired silica: recent developments and applications. Chem Commun. 47 (27), 7567-7582 (2011).
- Iler, R. K. . The Chemistry of Silica: Solubility, Polymerization, Colloid and Surface Properties and Biochemistry of Silica. , (1979).
- Forsyth, C., Yip, T. W. S., Patwardhan, S. V. CO2 sequestration by enzyme immobilized onto bioinspired silica. Chem Commun (Camb). 49 (31), 3191-3193 (2013).
- Forsyth, C., Patwardhan, S. V. Controlling performance of lipase immobilised on bioinspired silica. J Mater Chem B. 1 (8), 1164 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Ewlad-Ahmed, A. M., Morris, M. A., Patwardhan, S. V., Gibson, L. T. Removal of formaldehyde from air using functionalized silica supports. Environ Sci Technol. 46, 13354-13360 (2012).
- Yang, S. H., Ko, E. H., Jung, Y. H., Choi, I. S. Bioinspired functionalization of silica-encapsulated yeast cells. Angew Chemie. 50 (27), 6239-6242 (2011).
- Alotaibi, K. M., et al. Iron supported on bioinspired green silica for water remediation. Chem Sci. 8 (1), 567-576 (2017).
- Davidson, S., Lamprou, D. A., Urquhart, A. J., Grant, M. H., Patwardhan, S. V. Bioinspired Silica Offers a Novel, Green, and Biocompatible Alternative to Traditional Drug Delivery Systems. ACS Biomater Sci Eng. 2 (9), 1493-1503 (2016).
- Patwardhan, S. V., Perry, C. C. Synthesis of enzyme and quantum dot in silica by combining continuous flow and bioinspired routes. Silicon. 2 (1), 33-39 (2010).
- Nozawa, K., et al. Smart control of monodisperse stöber silica particles: Effect of reactant addition rate on growth process. Langmuir. 21 (4), 1516-1523 (2005).
- Belton, D. J., Patwardhan, S. V., Annenkov, V. V., Danilovtseva, E. N., Perry, C. C. From biosilicification to tailored materials: optimizing hydrophobic domains and resistance to protonation of polyamines. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (16), 5963-5968 (2008).
- de Ávila, S. G., Silva, L. C. C., Matos, J. R. Optimisation of SBA-15 properties using Soxhlet solvent extraction for template removal. Microporous Mesoporous Mater. 234, 277-286 (2016).
- Cassiers, K., Van Der Voort, P., Vansant, E. F. Synthesis of stable and directly usable hexagonal mesoporous silica by efficient amine extraction in acidified water. Chem Commun. (24), 2489-2490 (2000).
- Tanev, P. T., Pinnavaia, T. J. Mesoporous Silica Molecular Sieves Prepared by Ionic and Neutral Surfactant Templating: A Comparison of Physical Properties. Chem Mater. 8 (8), 2068-2079 (1996).
