Epitel hücrelerinin Shigella enfeksiyon sırasında CA2 + yanıtları görüntüleme
Summary
Burada, kalsiyum (Ca2 +) yanıt Shigellatarafından enfekte HeLa hücreleri tarafından elde edildi görselleştirmek için protokolleri mevcut. Bakteriyel enfeksiyon parametrelerini optimize ve Ca2 + floresan problar ile görüntüleme, enfeksiyon kinetik büyük bir aralığı içinde bakteriler tarafından indüklenen atipik küresel ve yerel Ca2 + sinyalleri karakterize edilmektedir.
Abstract
CA2 + her yerde birden bulunan iyon tüm bilinen hücresel oluşum içinde yer var. Küresel Ca2 + yanıt hücre kaderini etkileyecek iken, bulunduğunuz yere konsantrasyonlarda iç mağazaları veya bir akını plazma zarı kanallardan serbest bırakmak için bağlantılı ücretsiz Ca2 + sitozolik, kortikal hücre işlemleri düzenler. Patojenler uygun ya da ana bilgisayar hücreleri tetikleyici yeniden yapılanma etkileyen büyük olasılıkla Ca sinyal2 + hem küresel hem de yerel ana bilgisayar plazma zarı temel aktin sitoiskeleti istila. Çünkü bu olaylar düşük frekanslarda üzerinde genişletilmiş kinetik sözde Stokastik bir şekilde ortaya çıkabilir, patojenler tarafından indüklenen Ca2 + sinyalleri analiz ele alınması gereken önemli teknik sorunlar yükseltir.
Burada, küresel ve yerel Ca2 + sinyalleri Shigella enfeksiyon epitel hücrelerinin üzerine tespiti için protokolleri raporu. Bu iletişim kuralları, eserler güneşe maruz bağlantılı ve Ca2 + floresan problar uyarma ile ilişkili duyarlilik troubleshot sıkı edinme parametreleri üzerinde tanımlanmış zaman dilimlerinde bir kontrol ederek Shigella işgali. Yordamlar genişletilmiş enfeksiyon kinetik kimyasal sonda Fluo-4 kullanarak sırasında küresel sitozolik Ca2 + sinyallerinin frekans ve genlik titizlikle analiz için uygulanır.
Introduction
CA2 + hücre iskeleti yeniden yapılanma, inflamatuar yanıt ve hücre ölüm yolu ana bilgisayar-patojen etkileşimleri1‘ e,2,3ile ilgili de dahil olmak üzere tüm bilinen hücre işlemleri düzenler. Fizyolojik şartlarda bazal sitozolik Ca2 + konsantrasyonları düşük, nM aralığı yüzlerce ama agonist stimülasyon üzerine geçici artar tabi. Bu varyasyonlar kez plazma ve endoplazmik retikulum membranlar eylem pompa ve kanalları yoluyla salınım davranış göstermek. Bu titreşimler desen dönem, süre ve Ca2 + artar genliği ile karakterizedir ve yanına hangi, sırayla, Ca2 + kod4,5 bilinen belirli yanıtlar hücreleri tarafından şifresi çözülür . Sitozolik Ca2 + konsantrasyonu patolojik şartlar altında sürekli bir artış mitokondrial membranlar permeabilization ve pro-apoptotik veya nekrotik faktörler6sürümü ile ilgili hücre ölümüne yol açabilir, 7.
Shigella, bacillary dizanteri hastalığının bir tip III salgı sistemi (T3SS)8,9kullanarak konak hücreleri effectors enjekte edilerek epitel hücreleri’yı işgal etti. Konak hücreleri Shigella işgali T3SS tarafından elde edildi yerel ve genel Ca2 + sinyalleri ile ilişkilidir. Gözenek oluşturan gelince toksinler, konak hücre zarlarında ekler ve T3SS effectors enjeksiyon olasılığı için gereklidir T3SS translocon PLC ve inositol (1, 4, 5) trisphosphate (InsP3) aktivasyonu için sorumlu-bağımlı Ca2 + serbest bırakın. Yerelleştirilmiş PLC stimülasyon ve sitelerde bir atipik uzun ömürlü InsP3 bağımlı Ca2 + Shigella işgali sonucu polimerli aktin birikimi ile birlikte10serbest bırakmak. Tip III efektör IpgD, bir phosphatidyl 4,5 bisphosphate (PIP2) -4-fosfataz, böylece yerel Ca2 + doğumdan katkıda InsP3 oluşturmak PLC için kullanılabilir substrat miktarı kontrol PIP2, yerel miktarını sınırlar Yanıt bakteri istilası siteleri11,12. Bu yerel Ca2 + yanıt-e doğru büyük olasılıkla aktin polimerizasyon Shigella işgal siteleri10katkıda bulunur. Ayrıca Shigellatarafından ancak, elde edildi küresel Ca2 + yanıtları için bakteri istilası işlemi gereksiz ama connexin hemichannels plazma zarı, açılış ve ATP sürümü olarak ekstrasellüler tetikler bir bölme. Yayımlanan ATP bir parakrin şekilde hareket sırayla, Ca2 + salınım yanıt virüslü hücrenin yanındaki hücrelerdeki uyarır. IpgD da düzensiz izole yanıt-e doğru yavaş dynamics ile içine küresel Ca2 + yanıt şekillendirme için sorumludur. Sonunda, uzun süreli bir bakteriyel enfeksiyon IpgD InsP3-aracılı Ca2 + sinyalleri inhibisyonu için yol açar. Ca2 + sinyal ile onun müdahale IpgD bir Ca2 +gecikmeler-bağımlı calpain harekete geçirmek önde gelen odak yapışma yapıları sökme ve erken müfreze ile enfekte hücreleri13.
CA2 + sinyalleri patogenezinde önemli yönlerini söz konusu iken, bir mikroorganizma kullanımı bir dizi klasik agonist çalışmalarda karşılaşılmayan teknik sorunlar yükseltir. Açıklanan protokoller burada sık kullanılan floresan Ca2 + kimyasal gösterge Shigella enfeksiyon sırasında yerel Ca2 + sinyalleri karakterize için tasarlanmış Fluo-4 kullanın. Ca2 + sinyal içinde bakteriyel effectors rolü tanımlamak için gerekli onların kantitatif analiz için uygulanan yordamlar yanı sıra bu sinyalleri tespiti için kritik adımları ele alınmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu el yazması Shigellagenişletilmiş kinetik sırasında genel Ca2 + yanıtlarının yanı sıra Shigella Invasion kısa kinetik sırasında yerel Ca2 + sinyalleri izlemeye mühendislik protokolünü açıklar. Aşağıda, bu Ca2 + tespiti en iyi duruma getirmek için ele alınması gereken sorunlar bulunabilir anahtar biyolojik süreçleri ile herhangi bir girişim en aza indirerek sinyalleri.
Kimyasal vs. Ca2 + probları g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jenny-Lee Thomassin el yazması düzenleme ona yardım için teşekkürler. İş ANR tarafından desteklenen hibe MITOPATHO ve PATHIMMUN, Labex Memolife ve PSL IDEX Shigaforce verir. Chunhui, Çin burs Konseyi bir doktora hibe alıcısının güneştir. Laurent Combettes ve Guy Tran Van Nhieu olan bir WBI-Fransa değişimi Tournesol programı N ° 31268YG alıcıları (Wallonie-Bruxelles International, Fonds de la Recherche Scientifique, Ministère Français des Affaires étrangères et européennes, Ministère de l’Enseignement supérieur et de la Recherche dans le kadro des Partenariats Hubert Curien).
Materials
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | |
| Metamorph version 7.7 | Universal Imaging | ||
| CoolLED illumination system pE-2 | Roper Scientific | ||
| micro-dish 35 mm, high | IBIDI | 81156 | |
| Trypticase Soy (TCS) broth | Thermofisher | B11768 | |
| TCS agar | Thermofisher | B11043 | |
| Congo red | Sigma-Aldrich | 75768 | |
| M90T-AfaE | Sun et al. 2017 | Shigella flexneri serotype V. expressing the AfaE adhesin | |
| ipgD-AfaE | Sun et al. 2017 | isogenic ipgD mutant strain expressing the AfaE adhesin |
References
- Ashida, H., Ogawa, M., Kim, M., Mimuro, H., Sasakawa, C. Bacteria and host interactions in the gut epithelial barrier. Nature Chemical Biology. 8 (1), 36-45 (2012).
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signaling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (1), 11-21 (2000).
- Strehler, E. E. Plasma membrane calcium ATPases: from generic Ca(2+) sump pumps to versatile systems for fine-tuning cellular Ca(2). Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (1), 26-33 (2015).
- Muallem, S. Decoding Ca2+ signals: a question of timing. Journal of Cell Biology. 170 (2), 173-175 (2005).
- Uhlen, P., Fritz, N. Biochemistry of calcium oscillations. Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (1), 28-32 (2010).
- Carneiro, L. A., et al. Shigella induces mitochondrial dysfunction and cell death in nonmyleoid cells. Cell Host & Microbe. 5 (2), 123-136 (2009).
- Horng, T. Calcium signaling and mitochondrial destabilization in the triggering of the NLRP3 inflammasome. Trends in Immunology. 35 (6), 253-261 (2014).
- Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. Bacterial type III secretion systems: specialized nanomachines for protein delivery into target cells. Annual Review of Microbiology. 68, 415-438 (2014).
- Ashida, H., Mimuro, H., Sasakawa, C. Shigella manipulates host immune responses by delivering effector proteins with specific roles. Frontiers in Immunology. 6, 219 (2015).
- Tran Van Nhieu, G., et al. Actin-based confinement of calcium responses during Shigella invasion. Nature Communications. 4, 1567 (2013).
- Niebuhr, K., et al. Conversion of PtdIns(4,5)P(2) into PtdIns(5)P by the S. flexneri effector IpgD reorganizes host cell morphology. The EMBO Journal. 21 (19), 5069-5078 (2002).
- Konradt, C., et al. The Shigella flexneri type three secretion system effector IpgD inhibits T cell migration by manipulating host phosphoinositide metabolism. Cell Host & Microbe. 9 (4), 263-272 (2011).
- Friedrich, P. The intriguing Ca2+ requirement of calpain activation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 323 (4), 1131-1133 (2004).
- Thomas, D., et al. A comparison of fluorescent Ca2+ indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+ signals. Cell Calcium. 28 (4), 213-223 (2000).
- Sun, C. H., et al. The Shigella type III effector IpgD recodes Ca2+ signals during invasion of epithelial cells. The EMBO Journal. 36 (17), 2567-2580 (2017).
- Allaoui, A., Menard, R., Sansonetti, P. J., Parsot, C. Characterization of the Shigella flexneri IpgD and IpgF genes, which are located in the proximal part of the mxi locus. Infection and Immunity. 61 (5), 1707-1714 (1993).
