Imaging Ca^{2 +} ответы во время инфекции Shigella эпителиальных клеток

CA^{2 +} регулирует все известные клеточных процессов, включая цитоскелета реорганизации, воспалительных реакций и пути смерти клетки, связанных с хост возбудитель взаимодействия^1,2,3. В физиологических условиях базальный цитозольной Ca^{2 +} концентрации являются низкими, в сотни Нм диапазона, но может подвергаться переходных увеличивается после стимуляции агонистов. Эти варианты часто показывают колебательной поведение через действие насосов и каналов на мембраны плазмы и эндоплазматического ретикулума. Эти колебания характеризуется период, продолжительность и амплитуды Ca^{2 +} увеличивается и расшифровывается клетками, которые, в свою очередь, вызывают конкретные ответы в то, что известно как Ca^{2 +} код^4,5 . Устойчивый рост в цитозольной Ca^{2 +} концентрации в патологических условиях может привести к смерти клетки, связанные с permeabilization митохондриальных мембран и выпуска pro-apoptotic или некротических факторов^{6, 7}.

Шигеллы, возбудитель бактериальной дизентерии, поражает эпителиальные клетки путем впрыскивать эффекторов в клетки хозяина, с использованием типа III секреторной системы (T3SS)^8,9. Шигеллы вторжения клеток хозяина ассоциируется с местными и глобальными Ca^{2 +} сигналы с T3SS. Что касается порами формирования токсинов, translocon T3SS, который вставляет узел клеточных мембран и требуется для инъекций эффекторов T3SS скорее всего отвечает за активацию PLC и инозитол (1, 4, 5) trisphosphate (InsP3)-зависимых Ca^{2 +} релиз. Сочетание локализованных стимуляции PLC и накопление полимеризованной актина на участках в результате вторжения шигеллы в нетипово долгосрочного InsP3-зависимых Ca^{2 +} выпуск¹⁰. Тип III эффекторных IpgD, фосфатидилхолин 4,5 Бисфосфат (PIP2) -4-фосфатазы, ограничивает количество местных PIP2, таким образом контролируя количество доступных субстрат для PLC для создания InsP3, которая способствует сосредоточение местных Ca^{2 +} ответы бактерий вторжения сайтов^11,12. Эти местные Ca^{2 +} ответы могут способствовать актина полимеризации Shigella вторжения сайты¹⁰. Глобальные Ca^{2 +} ответы, которые также вызвало, шигеллы, однако, являются необязательным для процесса бактерий вторжения, но инициировать открытие connexin hemichannels на плазматической мембраны и выпуска АТФ в внеклеточного отсека. Выпущенные СПС, действуя в духе паракринными, в свою очередь, стимулирует Ca^{2 +} колебательных реакций в клетках рядом с инфицированной клетки. IpgD также отвечает за формирование глобальных Ca^{2 +} ответы в неустойчивой изолированных ответов с медленной динамики. В конце концов после длительной бактериальной инфекции, IpgD приводит к ингибированию InsP3-опосредованной Ca^{2 +} сигналов. Через свое вмешательство с Ca^{2 +} сигнализации, IpgD задержки Ca^{2 +}-зависимой calpain активации, ведущих к разборке адгезии координационных структур и преждевременная отслойка инфицированных клеток¹³.

В то время как Ca^{2 +} сигналы участвуют в критические аспекты патогенеза, использования микроорганизма поднимает ряд технических проблем, которые не встречаются в классической агонист исследований. Протоколы, описанные здесь использовать часто используемые флуоресцентные Ca^{2 +} химический индикатор Fluo-4, который мы спроектирован, чтобы характеризовать местных Ca^{2 +} сигналов во время инфекции Shigella . Обсуждаются шаги критических для обнаружения этих сигналов, а также процедуры для их количественного анализа, который необходим для характеризуют роли бактериальной эффекторов в Ca^{2 +} сигнализации.