Ca^{2 +} Antworten Imaging während der Shigella Infektion von Epithelzellen

Ca^{2 +} regelt alle bekannten Zellprozesse, einschließlich Zellskelett Reorganisation, Entzündungsreaktionen und Zelle Tod Wege im Zusammenhang mit Wirt-Pathogen Interaktionen^1,2,3. Unter physiologischen Bedingungen basale cytosolische Ca^{2 +} Konzentrationen sind niedrig, in den Hunderten von nM-Bereich, aber können zu einem vorübergehenden Anstieg nach Agonist Stimulation unterzogen werden. Diese Variationen zeigen oft oszillierende Verhalten durch das Wirken von Pumpen und Kanäle im Plasma und endoplasmatische Retikulum Membranen. Das Muster dieser Schwingungen zeichnet sich durch die Zeit, Dauer und Amplitude der Ca^{2 +} erhöht und wird durch Zellen, die wiederum bestimmte Reaktionen lösen in, was als Ca^{2 +} Code^{4,5 bekannt entschlüsselt} . Eine nachhaltige Steigerung der cytosolischen Ca^{2 +} Konzentration unter pathologischen Bedingungen führen zum Zelltod führt die Permeabilisierung der mitochondrialen Membranen und die Freisetzung von Pro-apoptotische oder nekrotischen Faktoren^{6zugeordnet, 7}.

Shigella, dem Erreger der bazillendysenterie, dringt Epithelzellen durch Einspritzen von Effektoren in Wirtszellen mit einem Typ III-Sekretion System (T3SS)^8,9. Eine Shigella -Invasion von Wirtszellen ist verbunden mit lokalen und globalen Ca^{2 +} Signale ausgelöst durch die T3SS. Für Pore bilden Giftstoffe, die T3SS-Translocon, die fügt in Host Zellmembranen und ist erforderlich für die Injektion von T3SS Effektoren wahrscheinlich ist verantwortlich für die Aktivierung der SPS und der Inosit (1, 4, 5)-Trisphosphate (InsP3)-abhängige Ca^{2 +} lassen Sie los. Die Kombination aus der lokalisierten PLC-Stimulation und die Anhäufung von polymerisierten Aktin an Standorten eines Shigella Invasion führen eine untypisch lang andauernde InsP3-abhängige Ca^{2 +} release¹⁰. Der Typ-III-Effektor IpgD, ein Phosphatidyl 4,5-Bisphosphate (PIP2)-4-Phosphatase, beschränkt die lokalen PIP2, wodurch die Steuerung der Menge der verfügbaren Substrat für SPS, InsP3, generieren, die an die enge des lokalen Ca^{2 +} trägt Antworten bei bakteriellen Invasion Seiten^11,12. Diese lokalen Ca^{2 +} Antworten wahrscheinlich dazu beitragen, die Aktin-Polymerisation bei Shigella Invasion Websites¹⁰. Globalen Ca^{2 +} Antworten, die jedoch auch durch Shigella, ausgelöst werden sind entbehrlich für die bakterielle Invasion Prozess aber auslösen, die Öffnung der Connexin-Hemichannels an der Plasmamembran und die Freisetzung von ATP in der extrazellulären Fach. Freigesetzte ATP Parakrine handeln, stimuliert wiederum Ca^{2 +} oszillierende Reaktionen in den Zellen neben der infizierten Zelle. IpgD ist auch verantwortlich für die Gestaltung der globalen Ca^{2 +} Antworten zu unberechenbar isolierten Reaktionen mit langsamen Dynamik. IpgD führt schließlich, nach einer längeren bakterielle Infektion auf die Hemmung der InsP3-vermittelten Ca^{2 +} Signale. Durch seine Einmischung mit Ca^{2 +} Signalisierung IpgD verzögert eine Ca^{2 +}-abhängigen Calpain Aktivierung führt zu die Demontage der fokale Adhäsion Strukturen und die vorzeitige Ablösung von infizierten Zellen¹³.

Während Ca^{2 +} Signale wichtige Aspekte der Pathogenese beteiligt sind, wirft die Verwendung eines Mikroorganismus eine Reihe von technischen Herausforderungen, die nicht im klassischen Agonist Studien anzutreffen sind. Die Protokolle beschrieben verwenden Sie hier die häufigsten verwendeten fluoreszierenden Ca^{2 +} chemischen Indikator Fluo-4, die wir entwickelt, um lokale Ca^{2 +} Signale während einer Shigella Infektion zu charakterisieren. Schritte für die Erkennung dieser Signale werden erläutert, sowie Verfahren für die Quantitative Analyse, die erforderlich sind, um die Rolle der bakteriellen Effektoren in Ca^{2 +} Signalisierung zu charakterisieren.