Imaging Ca^{2 +} reacties tijdens Shigella besmetting van epitheliale cellen

CA^{2 +} regelt alle bekende cel procédés, met inbegrip van cel dood trajecten aan gastheer-pathogeen interacties^1,2,3gerelateerde cytoskeletal reorganisatie en inflammatoire reacties. Onder fysiologische omstandigheden, basale cytosolische Ca^{2 +} concentraties zijn laag, in de honderden nM-bereik, maar kunnen worden onderworpen aan tijdelijke verhogingen op agonist stimulatie. Deze variaties tonen vaak oscillerende gedrag door het optreden van pompen en kanalen in het plasma en endoplasmatisch reticulum membranen. Het patroon van deze oscillaties wordt gekenmerkt door de periode, duur en amplitude van Ca^{2 +} toeneemt, en wordt gedecodeerd door cellen die, op zijn beurt leiden specifieke reacties tot in wat bekend als de Ca^{2 +} code^{4,5 staat} . Een aanhoudende stijging van de cytosolische Ca^{2 +} concentratie onder pathologische omstandigheden kan leiden tot de dood van de cel die is gekoppeld aan de permeabilization van de mitochondriale membraan en de vrijlating van de pro-apoptotic of necrotische factoren^{6, 7}.

Shigella, de verwekker van bacillaire dysenterie, binnenvalt epitheliale cellen door het injecteren van effectoren in cellen van de gastheer met een type III secretie systeem (T3SS)^8,9. Een Shigella -invasie van cellen van de gastheer wordt geassocieerd met lokaal en mondiaal Ca^{2 +} signalen ontlokte door de T3SS. Wat betreft de porie-vormende toxinen, de T3SS translocon dat wordt ingevoegd in de celmembranen van de gastheer en is vereist voor de injectie van T3SS effectoren waarschijnlijk is verantwoordelijk voor de activering van PLC en de inositol (1, 4, 5) trisphosphate (InsP3)-afhankelijke Ca^{2 +} release. De combinatie van de gelokaliseerde PLC stimulatie en de accumulatie van gepolymeriseerde actine bij plaatsen van een Shigella invasie resultaat in een opslagruimte langdurige InsP3-afhankelijke Ca^{2 +} release¹⁰. Het type III effector IpgD, een fosfatidyl 4,5 difosfaat (PIP2) -4-fosfatase, beperkt de lokale hoeveelheid PIP2, waardoor de controle van de hoeveelheid beschikbaar materiaal voor PLC voor het genereren van InsP3, die aan de opsluiting van lokale Ca^{2 bijdraagt +} Reacties op^11,12van de sites van de bacteriële invasie. Deze lokale Ca^{2 +} reacties waarschijnlijk bijdragen tot de actine polymerisatie op Shigella invasie sites¹⁰. Global Ca^{2 +} antwoorden die ook door Shigella, echter ontlokte zijn zijn overbodig voor de invasie van bacteriën proces maar leiden tot de opening van connexin hemichannels op het plasma-membraan en de vrijlating van ATP in de extracellulaire compartiment. Vrijgegeven ATP handelen op een wijze van paracrine, op zijn beurt, stimuleert Ca^{2 +} oscillerende reacties in de cellen naast de geïnfecteerde cel. IpgD is ook verantwoordelijk voor het vormgeven van globale Ca^{2 +} reacties in grillige geïsoleerde reacties met langzame dynamiek. Uiteindelijk, na een langdurige bacteriële infectie leidt IpgD tot de remming van InsP3-gemedieerde Ca^{2 +} signalen. Via haar bemoeienis met Ca^{2 +} signalering, IpgD vertragingen een Ca^{2 +}-afhankelijke calpain activering leidt tot de demontage van focal hechting structuren en de voortijdige detachement van geïnfecteerde cellen¹³.

Terwijl Ca^{2 +} signalen bij kritieke aspecten van pathogenese betrokken zijn, verhoogt het gebruik van een micro-organisme een aantal technische uitdagingen die niet in klassieke agonist studies voordoen zich. De protocollen beschreven hier gebruik maken van de gebruikte TL Ca^{2 +} chemische indicator Fluo-4 die we ontworpen om te karakteriseren van lokale Ca^{2 +} signalen tijdens een Shigella -infectie. Stappen van cruciaal belang voor het opsporen van deze signalen worden besproken, evenals procedures voor hun kwantitatieve analyse die vereist is voor het karakteriseren van de rol van bacteriële effectoren in Ca^{2 +} signalering geïmplementeerd.