Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi
Summary
Biz üç boyutlu Caenorhabditis elegans germline. inşası için otomatik yöntemi mevcut Bizim yöntem sayısını ve her çekirdek germline ve analizleri germline protein dağıtım ve hücre iskeleti yapısı içindeki konumunu belirler.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline kök hücre geliştirme, Apoptozis ve kromozom dinamikleri dahil olmak üzere çeşitli biyolojik olarak önemli işlemleri incelemek için kullanılır. Germline mükemmel bir model olsa da, genellikle iki boyutlu zaman ve emek üç boyutlu analiz için gerekli nedeniyle analizidir. Bu tür çalışmalarda önemli dökümanları numarası/konumunu çekirdeği ve protein dağıtım germline içinde vardır. Burada, otomatik sayı ve germline her bölgede çekirdeği konumunu belirlemek için confocal mikroskobu ve Hesaplamalı yaklaşımları kullanarak germline analizini gerçekleştirmek için bir yöntem mevcut. Bizim yöntem da farklı genetik geçmişleri protein ifade üç boyutlu incelenmesi sağlar germline protein dağıtım analiz eder. Ayrıca, bizim çalışma belirli kayma gelişimsel gereksinimleri karşılamak germline farklı bölgelerinde hücre iskeleti mimaride varyasyonlar gösterir. Son olarak, bizim yöntemi otomatik her germline spermatheca Sperm sayımı etkinleştirir. Birlikte ele alındığında, bizim yöntemi C. elegans germline hızlı ve tekrarlanabilir fenotipik analizini etkinleştirir.
Introduction
Yollar memeliler ile sinyal koruma C. elegans birden çok biyolojik süreçlerin1,2eğitim için mükemmel bir model yapar. Bizim laboratuarımızda kök hücre gelişimi, Apoptozis ve gen ekspresyonu çalışmaya C. elegans germline kullanın. Germline üç boyutlu bir yapıdır, birçok çalışma iki boyutlu üç boyutlu analiz zaman alıcı ve emek yoğun doğası gereği vardır. İki boyutlu analiz germline vivo içinde olayları yanlış muhtemeldir. C. elegans yetişkin hermafrodit iki germline kolu, her biri bir farklılaşmamış devlet3,4distal germ hücreleri korur somatik distal ucu hücre (DTC) evler vardır. Bu germ hücreleri nüfuzunu, kaçan DTC’yi uzak hareket olarak ayırt etmek başlar ve germline proksimal sonuna ulaşmak yumurta ve sperm hale gelir. Bu işlem sırasında germ hücre çekirdeği mitoz, mayoz5,6için geçiş önce tabi. Sperm üretimini geçmesi sırasında yetişkinlik yumurta üretilmektedir gelişiminin larva aşamasında 4 (L4) tarafından tamamlanır. Sperm yumurta embriyo oluşturmak için nereye gübreliyorlar spermatheca içinde depolanır.
C. elegans değişiklikler çekirdek sayısı, apoptotik olaylar, kromozom dinamikleri ve protein ifade ve/veya Yerelleştirme7 sayısı sonuçlanan germline geliştirme etkileyebilir birden çok genetik ve çevresel faktörler ,8,9,10,11. Bu olayların analizi her aşamasında nükleer morfoloji ve dağıtım göre farklılaşma tanımlaması gerekir. Doğru bir şekilde bu parametreler büyük örnek boyutu ile el ile çözümlemek için emek ve zaman alıcı. Bu sakıncaları engelleyecek ve analiz tutarlılığını sağlamak için otomatik yöntemi C. elegans germline sayma çekirdekleri, çekirdek dağıtım, protein ifade, üç boyutlu incelenmesi için geliştirdiğimiz ve hücre iskeleti yapısı. Confocal mikroskobu ile üç boyutlu render birleştirerek, boyutu ve şekli parametreleri her aşamasında germ hücre farklılaşma tanımlanması için oluşturulan. Ayrıca, bu yöntem germ hücre çekirdeği ve sperm sayım artı kromozom sayısı her yumurta içinde Puanlama sağlar.
Bir çok önemli germline germline yuvası, AIDS sitoplazmik akarsu ve koruma germline çekirdeği12istikrar sağlar sitoiskeleti yapıdır. Hesaplamalı işlemesini kullanan, biz germline sitoiskeleti üç boyutlu rekonstrüksiyon uygulandı ve farklı hücre iskeleti özellikle germline içinde teşhis etti. Burada, biz nasıl sayısal analiz confocal görüntüleme sağlar kapsamlı analiz C. elegans germline ile kombine göstermek için adım adım bir protokol tanımlamak.
C. elegans germline (şekil 1) üç boyutlu analizi için hızlı bir yöntem öneriyorum. Üç boyutlu analizi kullanılarak, otomatik germline çekirdeği (Şekil 2 ve şekil 3), üç boyutlu dağılımı hücreleri (Resim 2), ( germline sitoiskeleti yeniden inşası sayma çalışma olanağı vardır Şekil 3), proteinler (şekil 4) ve spermatheca sperm ve yumurta (şekil 5) kromozom sayısı puanlama dağıtımını. Yöntem sadece germline kolay ve doğru miktar sağlar ama fizyolojik ilgili fenotipleri tanımlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim kuralı doğruluğunu geliştirmek ve germline analiz için gereken süreyi azaltmak için hedeftir. Disseke germlines standart hazırlanması sonra germline çekirdeği üç boyutlu bir model Hesaplamalı işleme tarafından hazırlanmıştır. Germline çekirdeği dağıtım uzay gözlem izin verirken, üç boyutlu işleme germline belirli bölgelerinde, çekirdeği sayısını hesaplar. Önemli bir özelliği, bizim yöntemi çekirdek boyutu ve şekli parametreleri doğru tanımıdır. Bu boyama ve kullan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Monash Microimaging onların teknik destek için teşekkür ederiz. Bazı suşları NIH ofisi araştırma altyapı programları (P40 OD010440) tarafından finanse edilen Caenorhabditis genetik Merkezi tarafından temin edilmiştir. Bu eser bir Monash Üniversitesi Biyomedikal keşif Bursu, NHMRC proje desteği (GNT1105374), NHMRC üst düzey araştırma bursu (GNT1137645) ve veski yenilik bursu tarafından desteklenmiştir: Roger Pocock VIF 23.
Materials
| C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| OP50 Escherichia coli bacteria | Homemade | ||
| Nematode Growth Media (NGM) plates | Homemade | ||
| polyclonal rabbit anti-REC-8 | SDIX | 29470002 | |
| Alexa 488 conjugated antibody raised in goat | Thermofisher Scientific | A-21236 | |
| Cytoskeletal dye phalloidin | Thermofisher Scientific | A-12380 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | 62248 | |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P5899 | |
| Tetramisol | Sigma Aldrich | P5899 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506 | |
| 1M HEPES buffer, pH 7.4 | Sigma Aldrich | G0887 | |
| 10X PBS pH 7.4 | Thermofisher Scientific | AM9625 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1389 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| 37% Paraformaldehyde solution | Merck Millipore | 1040031000 | |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Fluoroshield fixing reagent | Sigma Aldrich | F6182 | |
| Ethanol | Millipore | 1009832511 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| 20°C & 25°CIncubator | Any brand | ||
| Light microscope | Any brand | ||
| Confocal microscope | Any brand (Leica, Zeiss) | ||
| Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software. | Bitplane | ||
| Phospho buffered saline, pH 7.4 | Homemade | ||
| Teflon microscope slides | Tekdon | 941-322-8288 |
References
- Hubbard, E. J. Caenorhabditis elegans germ line: a model for stem cell biology. Dev Dyn. 236 (12), 3343-3357 (2007).
- Joshi, P. M., Riddle, M. R., Djabrayan, N. J., Rothman, J. H. Caenorhabditis elegans as a model for stem cell biology. Dev Dyn. 239 (5), 1539-1554 (2010).
- Kershner, A., et al. Germline stem cells and their regulation in the nematode Caenorhabditis elegans. Adv Exp Med Biol. 786, 29-46 (2013).
- Byrd, D. T., Knobel, K., Affeldt, K., Crittenden, S. L., Kimble, J. A DTC niche plexus surrounds the germline stem cell pool in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 9 (2), 88372 (2014).
- Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the sperm/oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 405-433 (2007).
- Hansen, D., Hubbard, E. J., Schedl, T. Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline. Dev Biol. 268 (2), 342-357 (2004).
- Crittenden, S. L., et al. A conserved RNA-binding protein controls germline stem cells in Caenorhabditis elegans. Nature. 417 (6889), 660-663 (2002).
- Eckmann, C. R., Crittenden, S. L., Suh, N., Kimble, J. GLD-3 and control of the mitosis/meiosis decision in the germline of Caenorhabditis elegans. Genetics. 168 (1), 147-160 (2004).
- Schumacher, B., et al. Translational repression of C. elegans p53 by GLD-1 regulates DNA damage-induced apoptosis. Cell. 120 (3), 357-368 (2005).
- McMullen, P. D., et al. Macro-level modeling of the response of C. elegans reproduction to chronic heat stress. PLoS Comput Biol. 8 (1), 1002338 (2012).
- Hubbard, E. J., Korta, D. Z., Dalfo, D. Physiological control of germline development. Adv Exp Med Biol. 757, 101-131 (2013).
- Wolke, U., Jezuit, E. A., Priess, J. R. Actin-dependent cytoplasmic streaming in C. elegans oogenesis. Development. 134 (12), 2227-2236 (2007).
- Jones, A. R., Francis, R., Schedl, T. GLD-1, a cytoplasmic protein essential for oocyte differentiation, shows stage- and sex-specific expression during Caenorhabditis elegans germline development. Dev Biol. 180 (1), 165-183 (1996).
- Hasegawa, E., Karashima, T., Sumiyoshi, E., Yamamoto, M. C. elegans CPB-3 interacts with DAZ-1 and functions in multiple steps of germline development. Dev Biol. 295 (2), 689-699 (2006).
- Austin, J., Kimble, J. glp-1 is required in the germ line for regulation of the decision between mitosis and meiosis in C. elegans. Cell. 51 (4), 589-599 (1987).
- Berry, L. W., Westlund, B., Schedl, T. Germ-line tumor formation caused by activation of glp-1, a Caenorhabditis elegans member of the Notch family of receptors. Development. 124 (4), 925-936 (1997).
- Fox, P. M., Schedl, T. Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (1), 167-184 (2015).
- Pasierbek, P., et al. A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction. Genes and Development. 15 (11), 1349-1360 (2001).
- Klass, M., Wolf, N., Hirsh, D. Development of the male reproductive system and sexual transformation in the nematode Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 52 (1), 1-18 (1976).
- Korta, D. Z., Tuck, S., Hubbard, E. J. S6K links cell fate, cell cycle and nutrient response in C. elegans germline stem/progenitor cells. Development. 139 (5), 859-870 (2012).
- Laband, K., et al. Chromosome segregation occurs by microtubule pushing in oocytes. Nat Commun. 8 (1), 1499 (2017).
