ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא
Summary
אנו מציגים שיטה אוטומטית עבור שחזור תלת מימדי של Caenorhabditis elegans germline. השיטה שלנו קובעת את המספר והמיקום של כל גרעין בתוך germline ו ניתוחים germline חלבון הפצה, מבנה cytoskeletal.
Abstract
Germline Caenorhabditis elegans (C. elegans) משמש כדי ללמוד מספר תהליכי ביולוגית חשובה כולל תאי גזע, אפופטוזיס ופיתוח כרומוזום דינמיקה. בעוד germline מודל מעולה, הניתוח הוא לעתים קרובות שני עקב זמן העבודה הנדרש לצורך ניתוח תלת-ממדי. המפרט הגדולות במחקרים כאלה הם המיקום/המספר של גרעינים והפצה חלבון בתוך germline. כאן, אנו מציגים שיטה לבצע ניתוח אוטומטיות של germline באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וגישות חישובית כדי לקבוע את המספר והמיקום של גרעינים בכל אזור של germline… השיטה שלנו מנתחת גם הפצה חלבון germline המאפשרת בחינה תלת מימדי של חלבון ביטוי מרקע גנטי. יתר על כן, המחקר שלנו מראה וריאציות באדריכלות cytoskeletal באזורים שונים של germline עשוי להכיל דרישות ספציפיות מרחבי התפתחותית. לבסוף, השיטה שלנו מאפשר אוטומטיות ספירת הזרע ב spermatheca של כל germline. יחדיו, השיטה שלנו מאפשר ניתוח פנוטיפי מהיר ולא לשחזור germline C. elegans .
Introduction
שימור איתות המסלולים עם יונקים גורם C. elegans מודל מצויין ללמוד תהליכים ביולוגיים מספר1,2. במעבדה שלנו, אנו משתמשים germline C. elegans ללמוד תאי גזע, אפופטוזיס ופיתוח גנים. בעוד germline מבנה תלת מימדי, מחקרים רבים הם שניים בשל אופיו מהגידולים ועתירת של ניתוח תלת-ממדי. זה סביר מאוד כי ניתוח דו מימדי עלול לסלף ויוו אירועים ב germline. ההרמפרודיט למבוגרים C. elegans יש שתי זרועות germline, שכל אחד מהם בתים תא עצה דיסטלי סומאטית (DTC) המתחזק בתאי הנבט דיסטלי מצב וייעודים3,4. אלה בתאי הנבט מתחילים להבחין כאשר הם עוברים מן ה-DTC, בריחה השפעתה, ולהיות oocytes, זרע כפי שהם מגיעים לסוף הפרוקסימלית של germline. במהלך תהליך זה, גרעינים תא הנבט עוברים מיטוזה, לפני המעבר מיוזה5,6. ייצור הזרע מתבצעת באמצעות והעשים 4 (L4) של ההתפתחות, אחרי אשר oocytes מיוצרים במהלך הבגרות. הזרע נשמרות בתיקיה spermatheca שבו הם לדשן את oocytes כדי להפיק עוברי.
ישנם מספר גורמים גנטיים וסביבתיים יכולים להשפיע על התפתחות germline ב- C. elegans וכתוצאה מכך שינויים מספר גרעינים, מספר אירועים אפופטוטיים להיפגע, דינמיקה כרומוזום, ביטוי חלבונים ו/או לוקליזציה7 ,8,9,10,11. הניתוח של אירועים אלה דורש הזיהוי בכל שלב של בידול בהתבסס על מורפולוגיה גרעיני והפצה. לנתח במדויק את הפרמטרים הללו באופן ידני עם גודל מדגם גדולים הוא מהגידולים ולגזול. כדי לעקוף את החסרונות האלה ולאפשר את העקביות של ניתוח, פיתחנו שיטה אוטומטית בחינת תלת מימדי C. elegans germline לספור גרעינים, גרעינים הפצה, ביטוי חלבונים, ו cytoskeletal מבנה. על ידי שילוב מיקרוסקופיה קונפוקלית עם עיבוד תלת מימדי, יצרנו פרמטרים הגודל והצורה לצורך הזיהוי בכל שלב של בידול תא הנבט. יתרה מזאת, שיטה זו מאפשרת ספירת גרעיני תא נבט, זרע בתוספת ניקוד של כרומוזום מספר ב כל oocyte.
מבנה מכריע אחד ב germline הוא שלד התא, אשר מספק יציבות germline תא, איידס cytoplasmic streaming, הגנה germline הגרעינים12. באמצעות עיבוד חישובית, עלינו לבצע שחזור תלת מימדי של שלד התא germline, זיהה תכונות cytoskeletal שונות בתוך germline. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול צעד אחר צעד כדי להמחיש כיצד חישובית ניתוח בשילוב עם קונאפוקלית הדמיה מאפשר ניתוח מקיף של germline C. elegans .
אנו מציעים שיטה מהירה עבור ניתוח תלת-ממדי של C. elegans germline (איור 1). באמצעות ניתוח תלת-ממדי, זה אפשרי ללמוד תלת מימדי התפלגות אוטומטית germline גרעינים (איור 2 , איור 3), ספירת תאים (איור 2), שחזור של שלד התא germline ( איור 3), הפצה של חלבונים (איור 4), וניקוד מספר הזרע אצל spermatheca הכרומוזומים oocytes (איור 5). השיטה לא רק מאפשר כימות קל ומדויק germline אלא מזהה פנוטיפים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית.
Protocol
Representative Results
Discussion
המטרה של פרוטוקול זה נועד לשפר את הדיוק ולצמצם את משך הזמן הנדרש לצורך ניתוח germline. לאחר הכנת תקן germlines גזור, מודל תלת מימדי של גרעינים germline מוכן על ידי עיבוד חישובית. תוך מתן אפשרות התבוננות germline הפצה גרעינים בחלל, עיבוד תלת מימדי מחשבת את מספר גרעינים על אזורים ספציפיים של germline. היבט קריטי ש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים Microimaging מונש לתמיכה טכנית שלהם. זנים מסוימים נמסרו על ידי המרכז גנטיקה Caenorhabditis , אשר ממומן על ידי משרד NIH תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440). עבודה זו נתמכה על ידי מלגת גילוי וההתערבות של אוניברסיטת מונש, גרנט פרויקט NHMRC (GNT1105374), מלגת מחקר בכיר NHMRC (GNT1137645), וסקי חדשנות מלגת: 23 ערנית על רוג’ר Pocock.
Materials
| C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| OP50 Escherichia coli bacteria | Homemade | ||
| Nematode Growth Media (NGM) plates | Homemade | ||
| polyclonal rabbit anti-REC-8 | SDIX | 29470002 | |
| Alexa 488 conjugated antibody raised in goat | Thermofisher Scientific | A-21236 | |
| Cytoskeletal dye phalloidin | Thermofisher Scientific | A-12380 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | 62248 | |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P5899 | |
| Tetramisol | Sigma Aldrich | P5899 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506 | |
| 1M HEPES buffer, pH 7.4 | Sigma Aldrich | G0887 | |
| 10X PBS pH 7.4 | Thermofisher Scientific | AM9625 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1389 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| 37% Paraformaldehyde solution | Merck Millipore | 1040031000 | |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Fluoroshield fixing reagent | Sigma Aldrich | F6182 | |
| Ethanol | Millipore | 1009832511 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| 20°C & 25°CIncubator | Any brand | ||
| Light microscope | Any brand | ||
| Confocal microscope | Any brand (Leica, Zeiss) | ||
| Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software. | Bitplane | ||
| Phospho buffered saline, pH 7.4 | Homemade | ||
| Teflon microscope slides | Tekdon | 941-322-8288 |
References
- Hubbard, E. J. Caenorhabditis elegans germ line: a model for stem cell biology. Dev Dyn. 236 (12), 3343-3357 (2007).
- Joshi, P. M., Riddle, M. R., Djabrayan, N. J., Rothman, J. H. Caenorhabditis elegans as a model for stem cell biology. Dev Dyn. 239 (5), 1539-1554 (2010).
- Kershner, A., et al. Germline stem cells and their regulation in the nematode Caenorhabditis elegans. Adv Exp Med Biol. 786, 29-46 (2013).
- Byrd, D. T., Knobel, K., Affeldt, K., Crittenden, S. L., Kimble, J. A DTC niche plexus surrounds the germline stem cell pool in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 9 (2), 88372 (2014).
- Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the sperm/oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 405-433 (2007).
- Hansen, D., Hubbard, E. J., Schedl, T. Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline. Dev Biol. 268 (2), 342-357 (2004).
- Crittenden, S. L., et al. A conserved RNA-binding protein controls germline stem cells in Caenorhabditis elegans. Nature. 417 (6889), 660-663 (2002).
- Eckmann, C. R., Crittenden, S. L., Suh, N., Kimble, J. GLD-3 and control of the mitosis/meiosis decision in the germline of Caenorhabditis elegans. Genetics. 168 (1), 147-160 (2004).
- Schumacher, B., et al. Translational repression of C. elegans p53 by GLD-1 regulates DNA damage-induced apoptosis. Cell. 120 (3), 357-368 (2005).
- McMullen, P. D., et al. Macro-level modeling of the response of C. elegans reproduction to chronic heat stress. PLoS Comput Biol. 8 (1), 1002338 (2012).
- Hubbard, E. J., Korta, D. Z., Dalfo, D. Physiological control of germline development. Adv Exp Med Biol. 757, 101-131 (2013).
- Wolke, U., Jezuit, E. A., Priess, J. R. Actin-dependent cytoplasmic streaming in C. elegans oogenesis. Development. 134 (12), 2227-2236 (2007).
- Jones, A. R., Francis, R., Schedl, T. GLD-1, a cytoplasmic protein essential for oocyte differentiation, shows stage- and sex-specific expression during Caenorhabditis elegans germline development. Dev Biol. 180 (1), 165-183 (1996).
- Hasegawa, E., Karashima, T., Sumiyoshi, E., Yamamoto, M. C. elegans CPB-3 interacts with DAZ-1 and functions in multiple steps of germline development. Dev Biol. 295 (2), 689-699 (2006).
- Austin, J., Kimble, J. glp-1 is required in the germ line for regulation of the decision between mitosis and meiosis in C. elegans. Cell. 51 (4), 589-599 (1987).
- Berry, L. W., Westlund, B., Schedl, T. Germ-line tumor formation caused by activation of glp-1, a Caenorhabditis elegans member of the Notch family of receptors. Development. 124 (4), 925-936 (1997).
- Fox, P. M., Schedl, T. Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (1), 167-184 (2015).
- Pasierbek, P., et al. A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction. Genes and Development. 15 (11), 1349-1360 (2001).
- Klass, M., Wolf, N., Hirsh, D. Development of the male reproductive system and sexual transformation in the nematode Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 52 (1), 1-18 (1976).
- Korta, D. Z., Tuck, S., Hubbard, E. J. S6K links cell fate, cell cycle and nutrient response in C. elegans germline stem/progenitor cells. Development. 139 (5), 859-870 (2012).
- Laband, K., et al. Chromosome segregation occurs by microtubule pushing in oocytes. Nat Commun. 8 (1), 1499 (2017).
