Analyse de calcul de la lignée germinale de Caenorhabditis elegans pour étudier la Distribution des noyaux, les protéines et le cytosquelette

La conservation des voies avec mammifères de signalisation fait c. elegans , un excellent modèle pour étudier plusieurs processus biologiques^1,2. Dans notre laboratoire, nous utilisons la lignée germinale de c. elegans pour étudier le développement de cellules souches, l’apoptose et l’expression des gènes. Alors que la lignée germinale est une structure tridimensionnelle, de nombreuses études sont deux dimensions étant donné la nature de longues et fastidieuse de l’analyse en trois dimensions. Il est fort probable que l’analyse bidimensionnelle peut fausser in vivo d’évenements dans la lignée germinale. L’hermaphrodite adulte de c. elegans a deux branches de la lignée germinale, dont chacune abrite une cellule somatique distale (DTC) qui maintient les cellules germinales distales dans l’État indifférencié^3,4. Ces cellules germinales commencent à faire la différence car ils s’éloigner de la CRN, échapper à son influence et devenir des ovocytes et du sperme qu’ils atteignent l’extrémité proximale de la lignée germinale. Au cours de ce processus, les noyaux de cellules germinales subissent une mitose, avant de passer à la méiose^5,6. La production de spermatozoïdes est complétée par le stade larvaire 4 (L4), la mise au point, après quoi les ovocytes sont produites au cours de l’âge adulte. Les spermatozoïdes sont stockés dans la spermathèque où ils féconder les ovocytes à produire des embryons.

Il y a plusieurs facteurs génétiques et environnementaux qui peuvent influencer le développement des cellules germinales chez c. elegans , entraînant des changements dans le nombre de noyaux, nombre d’événements apoptotiques, dynamique des chromosomes et expression de la protéine ou localisation^{7 ,8,9,10,11}. L’analyse de ces événements nécessite l’identification de chaque étape de la différenciation basée sur la distribution et de la morphologie nucléaire. Afin d’analyser avec précision ces paramètres manuellement avec un grand échantillon est long et fastidieux. Pour contourner ces inconvénients et activez la cohérence de l’analyse, nous avons développé une méthode automatisée pour examen en trois dimensions de la lignée germinale de c. elegans pour compter les noyaux, distribution de noyaux, expression de la protéine et du cytosquelette structure. En combinant la microscopie confocale à rendu tridimensionnel, nous avons généré des paramètres de taille et de forme pour l’identification de chaque étape de la différenciation des cellules germinales. En outre, cette méthode permet de comptage des noyaux de cellules germinales et sperme plus marqué du nombre de chromosomes dans chaque ovocyte.

Une structure cruciale dans la lignée germinale est le cytosquelette, qui assure la stabilité de la lignée germinale compartiment, la cyclose sida et la protection de noyaux de cellules germinales¹². Utilisant le calcul rendu, nous avons effectué une reconstruction tridimensionnelle du cytosquelette des cellules germinales et identifié les caractéristiques du cytosquelette distinctes au sein de la lignée germinale. Nous décrivons ici un protocole étape par étape pour illustrer comment calcul analyse combinée d’imagerie confocale permet analyse détaillée de la lignée germinale de c. elegans .

Nous proposons une méthode rapide pour l’analyse tridimensionnelle de c. elegans lignée germinale (Figure 1). Selon l’analyse en trois dimensions, il est possible d’étudier la distribution tridimensionnelle des noyaux des cellules germinales (Figure 2 et Figure 3), automatisée comptage des cellules (Figure 2), reconstruction du cytosquelette germinale ( Figure 3), distribution des protéines (Figure 4) et ayant marqué le nombre de chromosomes dans les ovocytes (Figure 5) et de sperme dans la spermathèque. La méthode ne permet un dosage simple et précis de la lignée germinale mais identifie des phénotypes physiologiquement pertinents.