التحليل الحسابي ل Germline ايليجانس كاينورهابديتيس دراسة توزيع الأنوية، والبروتينات، وسيتوسكيليتون
Summary
نحن نقدم طريقة مؤتمتة لإعادة البناء ثلاثي الأبعاد من germline ايليجانس كاينورهابديتيس . أسلوبنا يحدد عدد والموقف من كل نواة داخل الخط وتحليلات germline البروتين التوزيع وهيكل cytoskeletal.
Abstract
يتم استخدام الخط ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) لدراسة عدة عمليات هامة بيولوجيا بما في ذلك ديناميات التنمية والمبرمج وكروموسوم الخلية الجذعية. بينما الفعل نموذجا رائعا، التحليل غالباً اثنان الأبعاد نظراً للوقت والعمالة اللازمة لتحليل ثلاثي الأبعاد. قراءات الرئيسية في مثل هذه الدراسات هي العدد/موقف النوى وتوزيع البروتين ضمن الفعل. نقدم هنا، طريقة لإجراء تحليل الآلي للخط استخدام الفحص المجهري [كنفوكل] والنهج الحسابية لتحديد عدد وموقف النوى في كل منطقة الفعل. كما يحلل لدينا أسلوب توزيع البروتين germline التي تمكن من فحص ثلاثي الأبعاد للبروتين في التعبير في مختلف الخلفيات الوراثية. علاوة على ذلك، يبين دراستنا الاختلافات في بنية سيتوسكيليتال في مناطق متميزة الفعل أنه يمكن استيعاب متطلبات التنمية المكانية محددة. وأخيراً، تمكن لدينا طريقة العد الآلي للحيوانات المنوية في سبيرماثيكا لكل germline. أخذت معا، تمكن لدينا أسلوب التحليل المظهرية السريع واستنساخه من germline C. ايليجانس .
Introduction
يجعل المحافظة على إشارات المسارات مع الثدييات C. ايليجانس نموذجا ممتازا لدراسة متعددة العمليات البيولوجية1،2. في لدينا مختبر، نستخدم germline C. ايليجانس لدراسة تطوير الخلايا الجذعية، والمبرمج، والتعبير الجيني. بينما الفعل هيكل ثلاثي الأبعاد، العديد من الدراسات وهما الأبعاد نظراً لطبيعة تحليل ثلاثي الأبعاد تستغرق وقتاً طويلاً وتتطلب عمالة مكثفة. أنه من المحتمل جداً أن تحليل الأبعاد قد تشوه في فيفو الأحداث في الفعل. وقد خنثي الكبار C. ايليجانس هما germline الأسلحة، كل منها يضم خلية جسدية نصيحة القاصي (DTC) الذي يحافظ على الخلايا الجرثومية القاصي في3،دولة غير متمايزة4. هذه الخلايا الجرثومية ابدأ أن يميز أنها تتحرك بعيداً عن DTC، الإفلات من تأثيرها، وتصبح بويضات والحيوانات المنوية كما أنها تصل إلى نهاية الدانية الفعل. وخلال هذه العملية، يخضع نواة الخلية الجرثومية الانقسام، قبل الانتقال إلى الانقسام الاختزالي5،6. اكتمال إنتاج الحيوانات المنوية بمرحلة اليرقات 4 (L4) التنمية، وبعد ذلك يتم إنتاج بويضات خلال مرحلة البلوغ. يتم تخزين الحيوانات المنوية في سبيرماثيكا حيث أنها تخصب بويضات لتوليد أجنة.
وهناك العديد من العوامل الوراثية والبيئية التي يمكن أن تؤثر على التنمية germline في C. ايليجانس أسفر عن تغييرات في عدد الأنوية، عدد من الأحداث أبوبتوتيك، وديناميات كروموسوم، وتعبير البروتين و/أو التعريب7 ،،من89،،من1011. تحليل هذه الأحداث تتطلب تحديد كل مرحلة من التمايز على أساس مورفولوجيا النووية والتوزيع. لدقة تحليل هذه المعلمات يدوياً مع حجم عينة كبيرة كثيفة العمالة وتستغرق وقتاً طويلاً. للالتفاف على هذه العيوب، ولتمكين اتساق التحليل، قمنا بتطوير أسلوب الآلي لفحص ثلاثي الأبعاد ل germline C. ايليجانس للنوى العد، وتوزيع الأنوية، تعبير البروتين، وسيتوسكيليتال الهيكل. بالجمع بين الفحص المجهري [كنفوكل] التقديم ثلاثي الأبعاد، نحن إنشاء معلمات حجم وشكل للتعرف على كل مرحلة من تمايز الخلية الجرثومية. علاوة على ذلك، يتيح هذا الأسلوب عد نواة الخلية الجرثومية والحيوانات المنوية بالإضافة إلى سجل لعدد الصبغيات في كل البويضات.
هيكل حاسم واحد في الفعل هو سيتوسكيليتون، الذي يوفر الاستقرار إلى حجرة germline والجري هيولى الإيدز والحماية بالفعل أنوية12. استخدام التقديم الحسابية، نحن إجراء إعادة البناء ثلاثي الأبعاد ل germline cytoskeleton وتحديد السمات المميزة سيتوسكيليتال ضمن الفعل. هنا، يمكننا وصف بروتوكول خطوة بخطوة لتوضيح التحليل الحسابي كيف جنبا إلى جنب مع [كنفوكل] التصوير يتيح تحليلاً شاملا ل germline C. ايليجانس .
ونحن نقترح طريقة سريعة لتحليل ثلاثي الأبعاد C. ايليجانس germline (الشكل 1). استخدام تحليل ثلاثي الأبعاد، فمن الممكن لدراسة توزيع ثلاثي الأبعاد من نوى germline (الشكل 2 و الشكل 3)، الآلي عد الخلايا (الشكل 2)، إعادة إعمار cytoskeleton germline ( 3 الرقم)، توزيع البروتينات (الشكل 4)، وسجل عدد الحيوانات المنوية في سبيرماثيكا والصبغيات في بويضات (الشكل 5). الأسلوب ليس فقط تمكن الكمي سهل ودقيق للخط ولكن يحدد تعمل فسيولوجيا ذات الصلة.
Protocol
Representative Results
Discussion
والهدف من هذا البروتوكول هو تحسين الدقة وتقليل الوقت اللازم لتحليل الخط. بعد إعداد قياسية من جيرملينيس تشريح، إعداد نموذج ثلاثي الأبعاد لنوى germline التقديم الحسابي. بينما يسمح لمراقبة توزيع الأنوية germline في الفضاء، التقديم ثلاثي الأبعاد بحساب عدد الأنوية في مناطق محددة الفعل. الجوانب البال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر ميكرويماجينج موناش لتقديم الدعم التقني لهم. وقدمت بعض سلالات كاينورهابديتيس مركز علم الوراثة، والذي يموله مكتب المعاهد الوطنية للصحة “برامج الهياكل الأساسية للبحوث” (P40 OD010440). هذا العمل كان يدعمها زمالة اكتشاف الطب الحيوي جامعة موناش، ومنحة مشروع NHMRC (GNT1105374)، NHMRC أقدم زمالة بحثية (GNT1137645) والزمالة الابتكار فيسكي: 23 VIF لروجر بوكوك.
Materials
| C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| OP50 Escherichia coli bacteria | Homemade | ||
| Nematode Growth Media (NGM) plates | Homemade | ||
| polyclonal rabbit anti-REC-8 | SDIX | 29470002 | |
| Alexa 488 conjugated antibody raised in goat | Thermofisher Scientific | A-21236 | |
| Cytoskeletal dye phalloidin | Thermofisher Scientific | A-12380 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | 62248 | |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P5899 | |
| Tetramisol | Sigma Aldrich | P5899 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506 | |
| 1M HEPES buffer, pH 7.4 | Sigma Aldrich | G0887 | |
| 10X PBS pH 7.4 | Thermofisher Scientific | AM9625 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1389 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| 37% Paraformaldehyde solution | Merck Millipore | 1040031000 | |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Fluoroshield fixing reagent | Sigma Aldrich | F6182 | |
| Ethanol | Millipore | 1009832511 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| 20°C & 25°CIncubator | Any brand | ||
| Light microscope | Any brand | ||
| Confocal microscope | Any brand (Leica, Zeiss) | ||
| Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software. | Bitplane | ||
| Phospho buffered saline, pH 7.4 | Homemade | ||
| Teflon microscope slides | Tekdon | 941-322-8288 |
References
- Hubbard, E. J. Caenorhabditis elegans germ line: a model for stem cell biology. Dev Dyn. 236 (12), 3343-3357 (2007).
- Joshi, P. M., Riddle, M. R., Djabrayan, N. J., Rothman, J. H. Caenorhabditis elegans as a model for stem cell biology. Dev Dyn. 239 (5), 1539-1554 (2010).
- Kershner, A., et al. Germline stem cells and their regulation in the nematode Caenorhabditis elegans. Adv Exp Med Biol. 786, 29-46 (2013).
- Byrd, D. T., Knobel, K., Affeldt, K., Crittenden, S. L., Kimble, J. A DTC niche plexus surrounds the germline stem cell pool in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 9 (2), 88372 (2014).
- Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the sperm/oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 405-433 (2007).
- Hansen, D., Hubbard, E. J., Schedl, T. Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline. Dev Biol. 268 (2), 342-357 (2004).
- Crittenden, S. L., et al. A conserved RNA-binding protein controls germline stem cells in Caenorhabditis elegans. Nature. 417 (6889), 660-663 (2002).
- Eckmann, C. R., Crittenden, S. L., Suh, N., Kimble, J. GLD-3 and control of the mitosis/meiosis decision in the germline of Caenorhabditis elegans. Genetics. 168 (1), 147-160 (2004).
- Schumacher, B., et al. Translational repression of C. elegans p53 by GLD-1 regulates DNA damage-induced apoptosis. Cell. 120 (3), 357-368 (2005).
- McMullen, P. D., et al. Macro-level modeling of the response of C. elegans reproduction to chronic heat stress. PLoS Comput Biol. 8 (1), 1002338 (2012).
- Hubbard, E. J., Korta, D. Z., Dalfo, D. Physiological control of germline development. Adv Exp Med Biol. 757, 101-131 (2013).
- Wolke, U., Jezuit, E. A., Priess, J. R. Actin-dependent cytoplasmic streaming in C. elegans oogenesis. Development. 134 (12), 2227-2236 (2007).
- Jones, A. R., Francis, R., Schedl, T. GLD-1, a cytoplasmic protein essential for oocyte differentiation, shows stage- and sex-specific expression during Caenorhabditis elegans germline development. Dev Biol. 180 (1), 165-183 (1996).
- Hasegawa, E., Karashima, T., Sumiyoshi, E., Yamamoto, M. C. elegans CPB-3 interacts with DAZ-1 and functions in multiple steps of germline development. Dev Biol. 295 (2), 689-699 (2006).
- Austin, J., Kimble, J. glp-1 is required in the germ line for regulation of the decision between mitosis and meiosis in C. elegans. Cell. 51 (4), 589-599 (1987).
- Berry, L. W., Westlund, B., Schedl, T. Germ-line tumor formation caused by activation of glp-1, a Caenorhabditis elegans member of the Notch family of receptors. Development. 124 (4), 925-936 (1997).
- Fox, P. M., Schedl, T. Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (1), 167-184 (2015).
- Pasierbek, P., et al. A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction. Genes and Development. 15 (11), 1349-1360 (2001).
- Klass, M., Wolf, N., Hirsh, D. Development of the male reproductive system and sexual transformation in the nematode Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 52 (1), 1-18 (1976).
- Korta, D. Z., Tuck, S., Hubbard, E. J. S6K links cell fate, cell cycle and nutrient response in C. elegans germline stem/progenitor cells. Development. 139 (5), 859-870 (2012).
- Laband, K., et al. Chromosome segregation occurs by microtubule pushing in oocytes. Nat Commun. 8 (1), 1499 (2017).
