Sentetik bir bakteriyel konsorsiyum Vitro Gut ana bilgisayar-mikrop arabirimde canlılık değerlendirilmesi
Summary
Gut ana bilgisayar-mikrop etkileşimleri sentetik bir sözlü topluluk, vitro gastrointestinal sindirim ve ince bağırsak epitel modeli birleştirerek yeni bir yaklaşım kullanarak değerlendirildi. Biz hücre istilası patojenler ve çoklu türler biyofilmler değerlendirmek veya bile probiyotik formülasyonları Beka sınamak için adapte edilebilir bir yöntem mevcut.
Abstract
Ana bilgisayar ile microbiota arasında Interplay uzun tanınmış ve geniş biçimde anlatılmıştır. Olarak ikamet microbiota oluşur ve eksojen bakteri kolonizasyonu engeller ağız gastrointestinal sistem, diğer bölümlere benzer olduğunu. Nitekim, 600’den fazla bakteri türleri ağız boşluğunda bulunur ve tek bir kişi etrafında 100 herhangi bir zamanda farklı taşıyabilir. Oral bakteri böylece yerleşik mikrobiyal topluluklar ve lehine büyüme ve hayatta kalma içinde entegre olma sözlü ekosistem çeşitli nişler uygun yeteneğine sahip. Ancak, yutma sırasında gut bakteri akışına gut microbiota dengesini rahatsız etmek önerdi. Aslında, P. gingivalis , sözlü yönetimi ileal mikrofloranın bakteriyel kompozisyon kaymıştır. Biz hayatta kalma ve canlılığı oral bakteri simüle gastrointestinal transit koşullara tabi aydınlatmak için doğal sözlü ekosistem basitleştirilmiş bir temsili sentetik bir topluluk kullanılır. On dört tür seçilen vitro tükürük, mide ve bağırsak sindirim işlemlere tabi ve gut mukozal epitel benzetimini yapmak için Caco-2 ve HT29-MTX hücreleri içeren bir multicompartment hücre modeli sundu. Bu model yuttu bakteri hücreleri enterohepatic dolaşımda yer üzerinde etkisini çözmeye devam eder. Sentetik topluluklar kullanarak kontrol edilebilirlik ve tekrarlanabilirlik için sağlar. Böylece, bu yöntemi patojen canlılığı ve sonraki iltihap ilişkili değişiklikler, probiyotik karışımları, kolonizasyon kapasitesini değerlendirmek için adapte edilebilir ve sonuçta, potansiyel bakteriyel presystemic dolaşım üzerinde etkisi.
Introduction
İnsanlar insan hücreleri1olarak aynı numarada bulunan bakteri ile birlikte yaşamak. Bu nedenle, bu çok önemli bir insan microbiome kapsamlı bir anlayış elde etmek önemlidir. Böylece çok çeşitli bakteri ve o farklı konumlardaki biyofilmler içeren birkaç daha küçük yaşam alanları bölünmüş oral kavite benzersiz bir ortam olmamasıdır. Açık bir ekosistem olmak, bazı türler ağız-ebilmek var olmak geçici ziyaretçi. Ancak, yakında Doğum ve form biyofilmler2düzenlenen sonra bazı mikroorganizmalar kolonize. Bunlar diş yüzeyi dişeti yarık, subgingival Aralık bașlığı, dil, mukozal yüzeyler ve diş protez ve dolgular3üzerinde bulunur. Flocs ve diş kanalı’nın lümen planktonik hücrelerde nekrotik hamuru doku ile karışıyor ya da bir sıvı faz askıya gibi bakteriler de mevcut olabilir.
Aktif, sürekli çapraz-hadis konak hücreleri ve ikamet microbiota4arasında vardır. Bakteri içinde ve türler arasında iletişim ve diğer bakteriler için birincil bu sömürgecilerin takmak iken doğal sömürgecilerin sadece küçük bir oranda dokulara, uygun. Örneğin, hücre-hücre bağlama mikroorganizmalar arasında ikincil sömürgecilerin sözlü biyofilmler entegre ve etkileşen mikrobiyal hücreleri4karmaşık ağ oluşturmak için anahtardır. Yaklaşık bir tükürük örneği bakteriyel toplamları % 70’i Porphyromonas sp., Streptococcus sp., Prevotella sp., Veillonella sp. ve tanımlanamayan Bacteroidetestarafından oluşturulur. F. nucleatum bir ara sömürge subgingival biyofilm ve toplamları periodontitis5‘ te karıştığı P. gingivalis, T. denticola ve Tannerella hor çiçeği, geç sömürgecilerin ile mevcuttur. Buna ek olarak, S. sanguinis ve S. gordonii diş3kolonize etmek tercih ederken Streptococcus mitis mukozal ve diş habitatları, kaplar. Özellikle naeslundii üst anteriors6‘ bulundu böylece, S. sanguinis alt kesici ve köpek dişi, mevcut ise.
Buna ek olarak, yerli microbiome insan sağlığı2korumada bir rol oynar. İkamet microbiota bağışıklık eğitim ve patojen genişleme engelleyen katılmaktadır. Çünkü yerli bakteri daha iyi adapte yüzeylere ekleme ve büyüme için kullanılabilir besin metabolising, daha verimli olabilir bu kolonizasyonu direnç oluşur. Probiyotik suşları gastrointestinal geçit hayatta kalmak ve etkin olarak kalır, ancak otokton bakteriler gastrointestinal sistem bir üst konumdan yuttu ve tam olarak tarif edilmiştir değil. Böylece, yapay bir topluluk, sözlü ekosistem temsilcisi simüle gastrointestinal transit koşullara tabi. Bakteriyel hücre canlılığı Bağırsak epitel benzeyen bir multicompartment modeli kullanılarak değerlendirildi. Geçerli gut simülatörleri luminal mikrobiyal topluluk7analizi açısından uygun tekrarlanabilirlik sunuyoruz. Hücre hatları mikrobiyal topluluklar ile birleştirerek8meydan okuyor gibi ancak, bakteriyel yapışma ve ana bilgisayar-mikrop etkileşim ayrı olarak, ele alınmaktadır. Buna ek olarak, biz başarılı kolonizasyon olaylar gut arabirimde bildirilen olası mekanik açıklama sağlar bir çerçeve mevcut. Gerçekten de, bu model ortaklaşa bir statik gut modeli ile yüzey sinyal (izleme) ana bilgisayar üzerinde mikrobiyal topluluklar etkisini değerlendirmek için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Oral microbiome bir insan sağlığı gibi son birkaç yazarlar20,21tarafından bildirilen unsurdur. Önceki bulgular tükürük bakteri büyük yükler içeren sindirim bir bağışıklık astar için ana sitelerin ince bağırsak mikrobiyal ekosistem üzerinde etkili olabileceği öneririz. Bir statik üst gastrointestinal sindirim modeli mikrobiyal bileşen ana bilgisayarda etkisini çözülmeye hizmet Bağırsak epitel ve mukus salgılayan hücreler tarafınd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar minnetle Flanders Araştırma Vakfı mali desteği Marta Calatayud Arroyo (iki doktora sonrası bursu-12N2815N) için kabul. Emma Hernandez-Sanabria Flanders yenilik ve Girişimcilik (Agentschap voor Innovatie kapı Wetenschap tr Technologie, IWT) tarafından desteklenen bir doktora sonrası adam var.
Materials
| STRAINS | |||
| Aggregatibacter actinomycetemcomitans | American Type Culture Collection | ATCC 43718 | |
| Fusobacterium nucleatum | American Type Culture Collection | ATCC 10953 | |
| Porphyromonas gingivalis | American Type Culture Collection | ATCC 33277 | |
| Prevotella intermedia | American Type Culture Collection | ATCC 25611 | |
| Streptococcus mutans | American Type Culture Collection | ATCC 25175 | |
| Streptococcus sobrinus | American Type Culture Collection | ATCC 33478 | |
| Actinomyces viscosus | American Type Culture Collection | ATCC 15987 | |
| Streptococcus salivarius TOVE-R | |||
| Streptococcus mitis | American Type Culture Collection | ATCC 49456 | |
| Streptococcus sanguinis | BCCM/LMG Bacteria Collection | LMG 14657 | |
| Veillonella parvula | Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures | DSM 2007 | |
| Streptococcus gordonii | American Type Culture Collection | ATCC 49818 | |
| CELL LINES | |||
| Caco-2 cells | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 86010202 | |
| HT29-MTX cells | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 12040401 | |
| REAGENTS AND CONSUMABLES | |||
| Brain Heart Infusion (BHI) broth | Oxoid | CM1135 | |
| Blood Agar 2 | Oxoid | CM0055 | Blood Agar medium |
| Menadione | Sigma | M9429 | |
| Hemin | Sigma | H9039 | |
| 5% sterile defibrinated horse blood | E&O Laboratories Ltd, | P030 | |
| InnuPREP PCRpure Kit | Analytik Jena | 845-KS-5010250 | PCR purification kit |
| Big Dye | Applied Biosystems | 4337454 | Dye for sequencing |
| ABI Prism BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit | Applied Biosystems | 4337456 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | |
| T25 culture flasks uncoated, cell-culture treated, vented, sterile | VWR | 734-2311 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924-100ML | |
| Trypan Blue solution 0.4%, liquid, sterile-filtered |
Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS | Gibco | 14190250 | |
| DMEM cell culture media, with GlutaMAX and Pyruvate | Life technologies | 31966-047 | |
| Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts | Sigma-Aldrich | CLS3450-24EA | |
| Mucin from porcine stomach Type II | Sigma-Aldrich | M2378 | |
| Inactivated fetal bovine serum | Greiner Bio One | 758093 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Triton X 100 for molecular biology | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DPBS without calcium, magnesium | Gibco | 14190-250 | |
| Pierce LDH Cytotoxicity Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 88953 | |
| Corning HTS Transwell-24 well, pore size 0.4 µm | Corning Costar Corp | 3450 | |
| Nuclease-free water | Serva Electrophoresis | 28539010 | |
| EQUIPMENT | |||
| Neubauer counting chamber improved | Carl Roth | T729.1 | |
| BD Accuri C6 Flow cytometer | BD Biosciences | 653118 | |
| PowerLyzer 24 Homogenizer | MoBio | 13155 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 186-1096 | |
| Flush system | Custom made | – | |
| InnOva 4080 Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | 8261-30-1007 | Shaker for 2.10 |
| Memmert CO2 incubator | Memmert GmbH & Co. | ICO150med | |
| Millicell ERS (Electrical Resistance System) | EMD Millipore, Merck KGaA | MERS00002 | |
| Millipore Milli-Q academic, ultra pure water system | Millipore, Merck KGaA | – | |
| Shaker (ROCKER 3D basic) | IKA | 4000000 | Shaker for 6.10 |
References
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Revised estimates for the number of human and bacteria cells in the body. PLoS Biology. 14, e1002533 (2016).
- Kelly, D., King, T., Aminov, R. Importance of microbial colonization of the gut in early life to the development of immunity. Mutation Research-Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. , 58-69 (2007).
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. Journal of Clinical Microbiology. 43, 5721-5732 (2005).
- Marsh, P. D., Head, D. A., Devine, D. A. Dental plaque as a biofilm and a microbial community-Implications for treatment. Journal of Oral Biosciences. 57, 185-191 (2015).
- Socransky, S. S., Haffajee, A. D., Cugini, M. A., Smith, C., Kent, R. L. Microbial complexes in subgingival plaque. Journal of Clinical Periodontology. 25, 134-144 (1998).
- Haffajee, A. D., et al. Subgingival microbiota in healthy, well-maintained elder and periodontitis subjects. Journal of Clinical Periodontology. 25, 346-353 (1998).
- Venema, K. Microbial metabolites produced by the colonic microbiota as drivers for immunomodulation in the host. The FASEB Journal. 27, (2013).
- Marzorati, M., et al. The HMI (TM) module: A new tool to study the Host-Microbiota Interaction in the human gastrointestinal tract in vitro. BMC Microbiology. 14, 133 (2014).
- Tanzer, J. M., Kurasz, A. B., Clive, J. Competitive displacement of mutans streptococci and inhibition of tooth-decay by Streptococcus-Salivarius Tove-R. Infection and Immunity. 48, 44-50 (1985).
- Slomka, V., et al. Nutritional stimulation of commensal oral bacteria suppresses pathogens: the prebiotic concept. Journal of Clinical Periodontology. 44, 344-352 (2017).
- Hernandez-Sanabria, E., et al. In vitro increased respiratory activity of selected oral bacteria may explain competitive and collaborative interactions in the oral microbiome. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 235 (2017).
- Alvarez, G., Gonzalez, M., Isabal, S., Blanc, V., Leon, R. Method to quantify live and dead cells in multi-species oral biofilm by real-time PCR with propidium monoazide. AMB Express. 3, (2013).
- Ehsani, E., et al. Initial evenness determines diversity and cell density dynamics in synthetic microbial ecosystems. Scientific Reports. 8, 340 (2018).
- Hernandez-Sanabria, E., et al. Correlation of particular bacterial PCR-denaturing gradient gel electrophoresis patterns with bovine ruminal fermentation parameters and feed efficiency traits. Applied and Environmental Microbiology. 76, 6338-6350 (2010).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nature Protocols. 2, 2276-2284 (2007).
- Calatayud, M., Velez, D., Devesa, V. Metabolism of inorganic arsenic in intestinal epithelial cell lines. Chemical Research in Toxicology. 25, 2402-2411 (2012).
- Minekus, M., et al. A standardised static in vitro digestion method suitable for food – an international consensus. Food & Function. 5, 1113-1124 (2014).
- Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73, 3283-3290 (2007).
- Props, R., Monsieurs, P., Mysara, M., Clement, L., Boon, N. Measuring the biodiversity of microbial communities by flow cytometry. Methods in Ecology and Evolution. 7, 1376-1385 (2016).
- Yamashita, Y., Takeshita, T. The oral microbiome and human health. Journal of Oral Science. 59, 201-206 (2017).
- Wade, W. G. The oral microbiome in health and disease. Pharmacological Research. 69, 137-143 (2013).
- Yu, M., et al. A resource for cell line authentication, annotation and quality control. Nature. 520, 307 (2015).
- Pelaseyed, T., et al. The mucus and mucins of the goblet cells and enterocytes provide the first defense line of the gastrointestinal tract and interact with the immune system. Immunological Reviews. 260, 8-20 (2014).
- Bengoa, A. A., et al. Simulated gastrointestinal conditions increase adhesion ability of Lactobacillus paracasei strains isolated from kefir to Caco-2 cells and mucin. Food Research International. 103, 462-467 (2018).
- Kleiveland, C. R., et al., Verhoeckx, K., et al. . The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , 197-205 (2015).
- Laparra, J. M., Sanz, Y. Comparison of in vitro models to study bacterial adhesion to the intestinal epithelium. Letters in Applied Microbiology. 49, 695-701 (2009).
- Gagnon, M., Berner, A. Z., Chervet, N., Chassard, C., Lacroix, C. Comparison of the Caco-2, HT-29 and the mucus-secreting HT29-MTX intestinal cell models to investigate Salmonella adhesion and invasion. Journal of Microbiological Methods. 94, 274-279 (2013).
- Großkopf, T., Soyer, O. S. Synthetic microbial communities. Current Opinion in Microbiology. 18, 72-77 (2014).
