تقييم جدوى اتحاد البكتيرية الاصطناعية على واجهة المضيف-ميكروب القناة الهضمية في المختبر
Summary
التفاعلات بين الميكروبات واستضافة القناة الهضمية قيمت استخدام نهجاً جديداً يجمع بين مجتمع شفوي اصطناعية و في المختبر الهضم المعدية المعوية، ونموذجا ظهارة الأمعاء. نحن نقدم طريقة التي يمكن تكييفها لتقييم غزو الخلية من مسببات الأمراض والأغشية الحيوية المتعددة الأنواع، أو حتى لاختبار قابلية بروبيوتيك الصيغ.
Abstract
وقد اعترف منذ زمن بعيد التفاعل بين المضيف والحجمية وعلى نطاق واسع ووصف. الفم مماثل إلى فروع أخرى من الجهاز الهضمي، كما يحدث الحجمية المقيمين ويمنع الاستعمار بالبكتيريا الخارجية. وفي الواقع، تم العثور على أكثر من 600 نوع من البكتيريا في تجويف الفم، وفرد واحد قد تحمل حوالي 100 مختلفة في أي وقت. بكتيريا الفم تمتلك القدرة على التمسك بالمنافذ المختلفة في النظام الإيكولوجي عن طريق الفم، وهكذا تصبح متكاملة داخل المجتمعات الميكروبية المقيمة، وتفضيل النمو والبقاء على قيد الحياة. ومع ذلك، اقترح تدفق البكتيريا إلى الأمعاء خلال البلع إلى الإخلال بتوازن الحجمية القناة الهضمية. في الواقع، تحولت الإدارة عن طريق الفم من جينجيفاليس P. تكوين البكتيرية في النبت لفائفي. أننا كمجتمع اصطناعية تمثيل مبسط للنظام الإيكولوجي الطبيعي عن طريق الفم، توضيح بالبقاء على قيد الحياة وبقاء البكتيريا عن طريق الفم يتعرضن لظروف محاكاة العبور الجهاز الهضمي. الأنواع الأربعة عشر المحددة، تعرض في المختبر اللعابية، والمعدة، وعمليات الهضم المعوية، وقدم إلى طراز مولتيكومبارتمينت خلية التي تحتوي على خلايا كربونات الكالسيوم-2 و HT29 MTX لمحاكاة ظهارة مخاطية الأمعاء. وعمل هذا النموذج لكشف تأثير البكتيريا ابتلع على الخلايا المعنية بتداول enterohepatic. يسمح استخدام المجتمعات الاصطناعية للتحكم وإمكانية تكرار نتائج. وهكذا، هذه المنهجية يمكن تكييفها لتقييم جدوى الممرض والتغيرات المرتبطة بالتهاب اللاحقة، قدرة الاستعمار من خلائط بروبيوتيك، وفي نهاية المطاف، البكتيرية المحتملة تؤثر على التداول بريسيستيميك.
Introduction
البشر التعايش مع البكتيريا، التي موجودة في نفس عدد الخلايا البشرية1. ومن ثم فمن المهم من أهمية حاسمة للحصول على فهم شامل ميكروبيومي البشرية. تجويف الفم بيئة فريدة من نوعها في ذلك ومقسمة إلى عدة الموائل أصغر، وبالتالي الذي يحتوي على مجموعة كبيرة ومتنوعة من البكتيريا والأغشية الحيوية في تلك المواقع المختلفة. ويجري فتح النظام إيكولوجي، قد تكون بعض الأنواع في الفم زائر عابر. ومع ذلك، بعض الكائنات المجهرية استعمار قريبا بعد الولادة وشكل تنظيم الأغشية الحيوية2. وتوجد هذه في سطح الأسنان أعلاه شق اللثة وشق سوبجينجيفال، واللسان، والأسطح المخاطية والأسنان الاصطناعية وحشوات3. يمكن أن تكون البكتيريا موجودة أيضا فلكس وخلايا العوالق في التجويف قناة الأسنان، أما ممزوج داخليا مع أنسجة اللب نخرية أو علقت في مرحلة السائل.
وهناك نشطة ومستمرة عبر الحديث بين الخلايا المضيفة و الحجمية المقيمين4. البكتيريا التواصل داخل وفيما بين الأنواع، وفقط نسبة صغيرة من المستعمرين الطبيعية يمكن أن تنضم إلى الأنسجة، بينما الأخرى البكتيريا إرفاق هذه المستعمرين الأولية. على سبيل المثال، خلية خلية الربط بين الكائنات الدقيقة هو المفتاح لدمج الثانوي المستعمرين في الأغشية الحيوية عن طريق الفم، وبناء شبكات معقدة من التفاعل الخلايا الجرثومية4. حوالي 70% مجاميع البكتيرية في عينة لعاب يتم تشكيلها من قبل بورفيروموناس sp. و العقدية sp.، بريفوتيلا sp.، فيلونيلا sp. ومجهولون باكتيرويديتيس. ف. نوكليتوم ، مستعمر وسيطة في بيوفيلم سوبجينجيفال والمجاميع مع المستعمرين أواخر P. جينجيفاليس، ت. دينتيكولا، و فورسيثيا تانيرلا، التي هي متورطة في التهاب اللثة5. وبالإضافة إلى ذلك، تحتل ميتس العقدية الموائل المخاطي والأسنان على حد سواء، بينما يفضل الدم س. وس. جوردو لاستعمار الأسنان3. وهكذا، والدم س. موجودة في أقل من القواطع والانياب، بينما تم العثور على نايسلوندي الحارش في أنتيريورس العلوي6.
وبالإضافة إلى ذلك، ميكروبيومي الأصلية يلعب دوراً في الحفاظ على صحة الإنسان2. وتشارك الحجمية المقيم في التعليم محصنة والحيلولة دون توسيع الممرض. مقاومة الاستعمار هذا يحدث بسبب البكتيريا الأصلية قد تكون أفضل تكييف في إرفاق للأسطح، وأكثر كفاءة في ميتابوليسينج المواد الغذائية المتاحة للنمو. لا وصف تماما على الرغم من أن سلالات الكائنات الحية المجهرية البقاء على قيد الحياة بمرور الجهاز الهضمي، ولا تزال نشطة، استمرار وجود البكتيريا أصلي ابتلع من موقع العلوي من الجهاز الهضمي. وهكذا، نتعرض جماعة اصطناعي، ممثل النظام الإيكولوجي عن طريق الفم، إلى ظروف محاكاة العبور الجهاز الهضمي. تم تقييم جدوى خلايا البكتيرية باستخدام نموذج مولتيكومبارتمينت تشبه ظهارة الأمعاء. الحالي القناة الهضمية المحاكاة توفر إمكانية تكرار نتائج مناسبة من حيث تحليل المجتمع الميكروبي لومينال7. ومع ذلك، التصاق البكتيريا والميكروبات والمضيف التفاعل كل على حدة تعالج، كالجمع بين خطوط الخلايا مع المجتمعات الميكروبية يتحدى8. وفي المقابل، نقدم إطارا يقدم شرحاً الميكانيكية المحتملة لإحداث الاستعمار الناجحة عن واجهة القناة الهضمية. في الواقع، استخدام هذا النموذج يمكن الاشتراك مع نموذج القناة الهضمية ثابتة لتقييم الأثر للمجتمعات الميكروبية على المضيف الإنذار سطحية.
Protocol
Representative Results
Discussion
ميكروبيومي عن طريق الفم عنصر أساسي في صحة الإنسان عنها مؤخرا في عدة المؤلفين20،21. تشير النتائج السابقة إلى أن ابتلاع اللعاب التي تحتوي على كميات كبيرة من البكتيريا يمكن أن تؤثر على النظام الإيكولوجي للميكروبات من الأمعاء الدقيقة، وواحد من المواقع الرئيسية …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب الاعتراف بامتنان الدعم المالي من “مؤسسة البحوث فلاندرز” إلى مارتا كاﻻتايود أرويو (فو بعد الدكتوراه زمالة-12N2815N). وأيما هرنانديز-سانابريا زميل ما بعد الدكتوراه تدعمها فلاندرز الابتكار وروح المبادرة (أجينتشاب voor إينوفاتي الباب ويتينشاب en تكنولوجي، IWT).
Materials
| STRAINS | |||
| Aggregatibacter actinomycetemcomitans | American Type Culture Collection | ATCC 43718 | |
| Fusobacterium nucleatum | American Type Culture Collection | ATCC 10953 | |
| Porphyromonas gingivalis | American Type Culture Collection | ATCC 33277 | |
| Prevotella intermedia | American Type Culture Collection | ATCC 25611 | |
| Streptococcus mutans | American Type Culture Collection | ATCC 25175 | |
| Streptococcus sobrinus | American Type Culture Collection | ATCC 33478 | |
| Actinomyces viscosus | American Type Culture Collection | ATCC 15987 | |
| Streptococcus salivarius TOVE-R | |||
| Streptococcus mitis | American Type Culture Collection | ATCC 49456 | |
| Streptococcus sanguinis | BCCM/LMG Bacteria Collection | LMG 14657 | |
| Veillonella parvula | Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures | DSM 2007 | |
| Streptococcus gordonii | American Type Culture Collection | ATCC 49818 | |
| CELL LINES | |||
| Caco-2 cells | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 86010202 | |
| HT29-MTX cells | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 12040401 | |
| REAGENTS AND CONSUMABLES | |||
| Brain Heart Infusion (BHI) broth | Oxoid | CM1135 | |
| Blood Agar 2 | Oxoid | CM0055 | Blood Agar medium |
| Menadione | Sigma | M9429 | |
| Hemin | Sigma | H9039 | |
| 5% sterile defibrinated horse blood | E&O Laboratories Ltd, | P030 | |
| InnuPREP PCRpure Kit | Analytik Jena | 845-KS-5010250 | PCR purification kit |
| Big Dye | Applied Biosystems | 4337454 | Dye for sequencing |
| ABI Prism BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit | Applied Biosystems | 4337456 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | |
| T25 culture flasks uncoated, cell-culture treated, vented, sterile | VWR | 734-2311 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924-100ML | |
| Trypan Blue solution 0.4%, liquid, sterile-filtered |
Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS | Gibco | 14190250 | |
| DMEM cell culture media, with GlutaMAX and Pyruvate | Life technologies | 31966-047 | |
| Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts | Sigma-Aldrich | CLS3450-24EA | |
| Mucin from porcine stomach Type II | Sigma-Aldrich | M2378 | |
| Inactivated fetal bovine serum | Greiner Bio One | 758093 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Triton X 100 for molecular biology | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DPBS without calcium, magnesium | Gibco | 14190-250 | |
| Pierce LDH Cytotoxicity Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 88953 | |
| Corning HTS Transwell-24 well, pore size 0.4 µm | Corning Costar Corp | 3450 | |
| Nuclease-free water | Serva Electrophoresis | 28539010 | |
| EQUIPMENT | |||
| Neubauer counting chamber improved | Carl Roth | T729.1 | |
| BD Accuri C6 Flow cytometer | BD Biosciences | 653118 | |
| PowerLyzer 24 Homogenizer | MoBio | 13155 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 186-1096 | |
| Flush system | Custom made | – | |
| InnOva 4080 Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | 8261-30-1007 | Shaker for 2.10 |
| Memmert CO2 incubator | Memmert GmbH & Co. | ICO150med | |
| Millicell ERS (Electrical Resistance System) | EMD Millipore, Merck KGaA | MERS00002 | |
| Millipore Milli-Q academic, ultra pure water system | Millipore, Merck KGaA | – | |
| Shaker (ROCKER 3D basic) | IKA | 4000000 | Shaker for 6.10 |
References
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Revised estimates for the number of human and bacteria cells in the body. PLoS Biology. 14, e1002533 (2016).
- Kelly, D., King, T., Aminov, R. Importance of microbial colonization of the gut in early life to the development of immunity. Mutation Research-Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. , 58-69 (2007).
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. Journal of Clinical Microbiology. 43, 5721-5732 (2005).
- Marsh, P. D., Head, D. A., Devine, D. A. Dental plaque as a biofilm and a microbial community-Implications for treatment. Journal of Oral Biosciences. 57, 185-191 (2015).
- Socransky, S. S., Haffajee, A. D., Cugini, M. A., Smith, C., Kent, R. L. Microbial complexes in subgingival plaque. Journal of Clinical Periodontology. 25, 134-144 (1998).
- Haffajee, A. D., et al. Subgingival microbiota in healthy, well-maintained elder and periodontitis subjects. Journal of Clinical Periodontology. 25, 346-353 (1998).
- Venema, K. Microbial metabolites produced by the colonic microbiota as drivers for immunomodulation in the host. The FASEB Journal. 27, (2013).
- Marzorati, M., et al. The HMI (TM) module: A new tool to study the Host-Microbiota Interaction in the human gastrointestinal tract in vitro. BMC Microbiology. 14, 133 (2014).
- Tanzer, J. M., Kurasz, A. B., Clive, J. Competitive displacement of mutans streptococci and inhibition of tooth-decay by Streptococcus-Salivarius Tove-R. Infection and Immunity. 48, 44-50 (1985).
- Slomka, V., et al. Nutritional stimulation of commensal oral bacteria suppresses pathogens: the prebiotic concept. Journal of Clinical Periodontology. 44, 344-352 (2017).
- Hernandez-Sanabria, E., et al. In vitro increased respiratory activity of selected oral bacteria may explain competitive and collaborative interactions in the oral microbiome. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 235 (2017).
- Alvarez, G., Gonzalez, M., Isabal, S., Blanc, V., Leon, R. Method to quantify live and dead cells in multi-species oral biofilm by real-time PCR with propidium monoazide. AMB Express. 3, (2013).
- Ehsani, E., et al. Initial evenness determines diversity and cell density dynamics in synthetic microbial ecosystems. Scientific Reports. 8, 340 (2018).
- Hernandez-Sanabria, E., et al. Correlation of particular bacterial PCR-denaturing gradient gel electrophoresis patterns with bovine ruminal fermentation parameters and feed efficiency traits. Applied and Environmental Microbiology. 76, 6338-6350 (2010).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nature Protocols. 2, 2276-2284 (2007).
- Calatayud, M., Velez, D., Devesa, V. Metabolism of inorganic arsenic in intestinal epithelial cell lines. Chemical Research in Toxicology. 25, 2402-2411 (2012).
- Minekus, M., et al. A standardised static in vitro digestion method suitable for food – an international consensus. Food & Function. 5, 1113-1124 (2014).
- Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73, 3283-3290 (2007).
- Props, R., Monsieurs, P., Mysara, M., Clement, L., Boon, N. Measuring the biodiversity of microbial communities by flow cytometry. Methods in Ecology and Evolution. 7, 1376-1385 (2016).
- Yamashita, Y., Takeshita, T. The oral microbiome and human health. Journal of Oral Science. 59, 201-206 (2017).
- Wade, W. G. The oral microbiome in health and disease. Pharmacological Research. 69, 137-143 (2013).
- Yu, M., et al. A resource for cell line authentication, annotation and quality control. Nature. 520, 307 (2015).
- Pelaseyed, T., et al. The mucus and mucins of the goblet cells and enterocytes provide the first defense line of the gastrointestinal tract and interact with the immune system. Immunological Reviews. 260, 8-20 (2014).
- Bengoa, A. A., et al. Simulated gastrointestinal conditions increase adhesion ability of Lactobacillus paracasei strains isolated from kefir to Caco-2 cells and mucin. Food Research International. 103, 462-467 (2018).
- Kleiveland, C. R., et al., Verhoeckx, K., et al. . The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , 197-205 (2015).
- Laparra, J. M., Sanz, Y. Comparison of in vitro models to study bacterial adhesion to the intestinal epithelium. Letters in Applied Microbiology. 49, 695-701 (2009).
- Gagnon, M., Berner, A. Z., Chervet, N., Chassard, C., Lacroix, C. Comparison of the Caco-2, HT-29 and the mucus-secreting HT29-MTX intestinal cell models to investigate Salmonella adhesion and invasion. Journal of Microbiological Methods. 94, 274-279 (2013).
- Großkopf, T., Soyer, O. S. Synthetic microbial communities. Current Opinion in Microbiology. 18, 72-77 (2014).
