İlk kalp alan benzeri kardiyak ataları ve ventrikül benzeri Cardiomyocytes insan Pluripotent kök hücrelerden nesil
Summary
Burada ilk kalp alan benzeri kardiyak ataları ve ventrikül benzeri cardiomyocytes insan pluripotent kök hücre üretmek için aktivin A ve lentivirus-aracılı ID1-overexpression, basit bir birleşimini kullanarak ölçeklenebilir bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Üretimi cardiomyocytes tanımlanmış kalp alan kökenli ve fonksiyonel insan pluripotent kök hücreler elde edilen kalp ataları büyük miktarda hücre tabanlı kardiyak terapiler ve hastalık modelleme için önceden gerekli olduğunu. Son zamanlarda kimliği genler gerekli ve omurgalı geliştirme sırasında ilk kalp alan ataları belirtmek yeterli olduğunu göstermiştir. Bu farklılaşma protokolü bu bulgular güçlendirir ve ID1 overexpression beraber aktivin A güçlü belirten cues olarak ilk kalp alan benzeri (FHF-L) ataları üretmek için kullanır. Önemlisi, ortaya çıkan ataları verimli (~ 70-%90) ventrikül benzeri cardiomyocytes ayırt etmek. Burada ayrıntılı bir yöntem 1) oluşturmak ID1-overexpressing hPSCs ve 2) ayırt ölçeklenebilir miktarda cryopreservable FHF-L ataları ve ventrikül benzeri cardiomyocytes açıklayın.
Introduction
Büyük ölçekli üretim insan pluripotent kök hücre (hPSCs)-türetilmiş kardiyak ataları ve cardiomyocytes olan kök hücre tabanlı terapiler1,2,3 ve hızlı karakterizasyonu modelleme hastalığı için önceden gerekli Kardiyak farklılaşma4,5,6 ve Fizyoloji7,8düzenleyen yeni yollar. Her ne kadar bir dizi çalışmalar9,10,11,12,13,14,15 daha önce açıklanan yüksek verimli hPSCs kardiyak farklılaşma kurallarından, hiçbiri sol arasında önemli moleküler farklılıklar tanımlaması rağmen elde edilen cardiomyocytes kalp alan kökeni açıklama (ilk kalp alanı) ve değil (İkinci kalp alanı) ventrikül cardiomyocytes16 ve kalp özel alan konjenital kalp hastalıkları varlığı; Yani, hipoplastik sol kalp sendromu17 veya Aritmojenik Sağ ventrikül displazi18. Böylece, kardiyak ataları nesil ve hPSCs üzerinden tanımlanmış kalp alan kökenli cardiomyocytes tedavi edici olarak kendi alaka artırmak için bir zorunluluk haline gelmektedir ve modelleme araçları hastalığı.
Bu iletişim kuralı ID1, bu aktivin A, birlikte gerekli ve yeterli cardiogenesis hPSCs içinde başlatmak yakın zamanda belirlenen5 ilk kalp alanı belirtmek isteka bünye overexpression kullanır. Özellikle, Cunningham vd. (2017) 5 göstermek onlar kalp farklılaşma geçmesi gibi ID1 kaynaklı ataları özellikle ilk kalp alanı (HCN4, TBX5) ama değil ikinci kalp alan işaretleri (SIX2, ISL1) ifade. Buna ek olarak, yazarlar da genler (ID1–4), tüm kimliği ailesi eksik transgenik fare embriyo geliştirmek ilk kalp alan kardiyak ataları, orta ve posterior kardiyak ataları () daha fazla süre kurma olmadan göster İkinci kalp) hala, böylece kimliği proteinler ilk kalp alan cardiogenesis vivo içindebaşlatmak için gerekli olan düşündüren form alanı. Elverişli bir konuma sahip, ID1 kaynaklı ataları cryopreserved ve kendiliğinden ventrikül benzeri özellikleri ventrikül özgü işaretleri (IRX4, MYL2) ifadesi de dahil olmak üzere, görüntüleme cardiomyocytes ayırt etmek ve ventrikül benzeri Aksiyon potansiyelleri.
Burada ilk kalp alan benzeri (FHF-L) kardiyak ataları ve ventrikül benzeri cardiomyocytes ID1 overexpressing hPSCs oluşturmak için basit ve ölçeklenebilir bir yöntemi açıklanmaktadır. Bu protokol önemli bir özelliği uygun dondurma adım kullanarak sonraki cardiomyocyte üretim kardiyak yaratıcı nesil çözmek için olasılık var. Özetle, bu iletişim kuralını (1) oluşturmak ID1-overexpressing hPSCs, oluşturmak (2) FHF-L kardiyak ataları hPSCs, (3) cryopreserve elde edilen ataları ve (4) FHF-L kardiyak progenitör farklılaşma sürdürmek için gerekli adımları detayları ve oluşturmak yüksek oranda zenginleştirilmiş (> % 70-90) ventrikül benzeri cardiomyocytes yenerek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Başarılı saptamaları için yakından yukarıda listelenen yönergeleri izleyin emin olun. Ayrıca, burada biz güçlü etkisi farklılaşma sonuçlar anahtar parametreleri vurgulayın. Bir farklılaşma başlamadan önce aşağıdaki üç morfolojik parametreleri dikkat edilmelidir: hPSCsID1, yüksek hücresel sıkıştırma ve yüksek bir izdiham bir kök morfolojisi (> % 90) gün 0 kültürünün. Bu konuda en iyi farklılaşma koşulları en iyi ayrışmış kaplama hPSCsID1 tek hücreler ola…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz yararlı tartışmalar Colas laboratuvar üyeleri ve kritik değerlendirme şekilde alt alta yazılmalıdır teşekkür ederim. Bu çalışmada NIH/NIEHS R44ES023521-02 tarafından desteklenen ve Dr Colas CIRM DISC2-10110 verir.
Materials
| ACTC1 antibody | Sigma | A7811 | |
| Activin A | Stem Cell Technologies | Hu Recom Activin A | |
| Antibiotic Antimycotic (Anti-Anti) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| B27 supplement w/o – insulin | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 supplement w/o – vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587001 | |
| CDH5 antibody | R&D Systems | AF938 | |
| CryoStor CS10 | Stem Cell Technologies | 7930 | Cryopreservation reagent |
| DMEM high Glucose | Mediatech | 10-013-CV | |
| DPBS w/ Ca & Mg | Corning | 21-030-CV | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | |
| FBS | VWR | 89510-186 | |
| FluoVolt membrane potential kit | Thermo Fisher Scientific | F10488 | For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017 |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Matrigel, Growth Factor Reduced | Corning | 356231 | Coating reagent |
| mTeSR1 media kit | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| PBS w/o Ca & Mg | Corning | 21-040-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | ||
| Puromycin | Acros | 227422500 | |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | Enzyme-free dissociation reagent |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| TAGLN antibody | Abcam | ab14106 | |
| Thiazovivin | Stem Cell Technologies | 72254 | RHO/ROCK pathway inhibitor |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605 -010 | 1X enzyme-containing dissociation reagent |
| Tyrodes solution mix packets | Sigma | T2145-10X1L | (For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017) |
References
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
- Kodo, K., et al. iPSC-derived cardiomyocytes reveal abnormal TGF-beta signalling in left ventricular non-compaction cardiomyopathy. Nature cell biology. 18, 1031-1042 (2016).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494, 105-110 (2013).
- Colas, A. R., et al. Whole-genome microRNA screening identifies let-7 and mir-18 as regulators of germ layer formation during early embryogenesis. Genes & development. 26, 2567-2579 (2012).
- Cunningham, T. J., et al. Id genes are essential for early heart formation. Genes & development. , (2017).
- McKeithan, W. L., Colas, A. R., Bushway, P. J., Ray, S., Mercola, M. Serum-free generation of multipotent mesoderm (Kdr+) progenitor cells in mouse embryonic stem cells for functional genomics screening. Current protocols in stem cell biology. , 13 (2012).
- McKeithan, W. L., et al. An automated platform for assessment of congenital and drug-induced arrhythmia with hipsc-derived cardiomyocytes. Frontiers in physiology. 8, 766 (2017).
- Sharma, A., et al. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science translational medicine. 9, (2017).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature methods. 11, 855-860 (2014).
- Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell stem cell. 8, 228-240 (2011).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature biotechnology. 25, 1015-1024 (2007).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1848-1857 (2012).
- Willems, E., et al. Small molecule-mediated TGF-beta type II receptor degradation promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells. Cell stem cell. 11, 242-252 (2012).
- Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453, 524-528 (2008).
- Palpant, N. J., et al. Generating high-purity cardiac and endothelial derivatives from patterned mesoderm using human pluripotent stem cells. Nature protocols. 12, 15-31 (2017).
- DeLaughter, D. M., et al. Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development. Developmental cell. 39, 480-490 (2016).
- Liu, X., et al. The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome. Nature genetics. 49, 1152-1159 (2017).
- Corrado, D., Link, M. S., Calkins, H. Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy. New England journal of medicine. 376, 1489-1490 (2017).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Experimental hematology. 31, 1007-1014 (2003).
