Geração do primeiro coração campo-como progenitores cardíaca e Cardiomyocytes Ventricular, como de células-tronco pluripotentes humanas
Summary
Aqui nós descrevemos um método dimensionável, usando uma simples combinação de Activin A e mediada por lentivirus Id1-superexpressão, para gerar a primeiras progenitores cardíaca como campo de coração e cardiomyocytes ventricular, como de células estaminais pluripotentes humanas.
Abstract
A geração de grandes quantidades de progenitores de cardíacas derivadas de células-tronco pluripotentes humanas funcional e cardiomyocytes de origem de campo definido de coração é um pré-requisito para terapias cardíacas baseada em célula e modelagem de doença. Recentemente mostramos que genes de identificação são necessárias e suficientes para especificar primeiros progenitores de campo do coração durante o desenvolvimento de vertebrados. Este protocolo de diferenciação aproveita esses achados e usa Id1 superexpressão em combinação com o Activin A como potentes especificando sugestões para produzir o primeiros progenitores de (FHF-L) de campo-como de coração. Importante, resultante de progenitores diferenciarem eficientemente (~ 70-90%) em ventricular, como cardiomyocytes. Aqui nós descrevemos um método detalhado para 1) gerar Id1-superexpressão hPSCs e 2) diferenciar quantidades escaláveis de progenitores de FHF-L cryopreservable e ventricular, como cardiomyocytes.
Introduction
Produção em larga escala de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs)-progenitoras cardíacas derivadas e cardiomyocytes é um pré-requisito para terapias baseadas em células-tronco1, doença de modelagem2,3 e a rápida caracterização do novo caminhos regulação cardíaca diferenciação4,5,6 e fisiologia7,8. Embora um número de estudos9,10,11,12,13,14,15 têm descrito anteriormente altamente eficiente protocolos de diferenciação cardíaca do hPSCs, nenhum abordou a origem do campo de coração dos cardiomyocytes resultante, apesar da identificação de diferenças significativas de moleculares entre a esquerda (primeiro campo do coração) e direita (segundo campo de coração) cardiomyocytes ventricular16 e a existência de cardiopatia congênita coração campo específico; ou seja, hipoplasia do coração esquerdo síndrome17 ou arritmogênica do ventrículo direito displasia18. Assim, a geração dos progenitores cardíacas e cardiomyocytes de origem de campo definido de coração de hPSCs está se tornando uma necessidade para aumentar a sua relevância como terapêutica e ferramentas de modelagem da doença.
Esse protocolo depende a superexpressão constitutiva de Id1, um recentemente identificados5 primeiro coração campo-especificando cue que, em combinação com A União, é necessário e suficiente para iniciar cardiogenesis em hPSCs. Notavelmente, Cunningham et al (2017) 5 mostrar que progenitores induzida por Id1 especificamente expressam primeiro campo de coração (HCN4, TBX5), mas não segundo marcadores de campo coração (SIX2, ISL1) como elas passam por diferenciação cardíaca. Além disso, os autores também mostram que os embriões de rato transgénico falta toda a família de identificação de genes (Id1–4), desenvolver sem formar primeiro coração campo cardíaca progenitores, enquanto mais progenitores cardíaca posterior e medial ( ainda pode formar o segundo campo de coração), assim, sugerindo que as proteínas do Id são essenciais para iniciar primeiro coração campo cardiogenesis na vivo. Convenientemente, progenitores Id1-induzida pode ser criopreservadas e diferenciar espontaneamente em cardiomyocytes exibindo ventricular-como características, incluindo a expressão de marcadores específicos ventricular (IRX4, MYL2) e ventricular, como potenciais de ação.
Aqui nós descrevemos um método simples e escalável para gerar primeiros progenitores cardíacas campo-como coração de (FHF-L) e ventricular, como cardiomyocytes de Id1 superexpressão hPSCs. Uma característica importante do presente protocolo é a possibilidade de desacoplar geração progenitoras cardíacas de produção casos subsequentes usando uma etapa de criopreservação conveniente. Em resumo, este protocolo detalha as etapas necessárias para (1) gerar Id1-superexpressão hPSCs, (2) gerar progenitoras cardíacas FHF-L de hPSCs, (3) cryopreserve resultante de progenitores e (4) retomar a diferenciação de progenitoras cardíacas FHF-L e gerar altamente enriquecido (> 70-90%) batendo ventricular, como cardiomyocytes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para diferenciações bem sucedidas, certifique-se de acompanhar de perto as instruções listadas acima. Além disso, aqui destacamos parâmetros-chave que influenciam fortemente os resultados de diferenciação. Antes de iniciar uma diferenciação, devem ser observados os seguintes três parâmetros morfológicos: uma morfologia de tronco de hPSCsId1, uma alta compactação celular e uma confluência de alta (> 90%) da cultura no dia 0. A esse respeito, condições ideais de diferenciação são melhor cria…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a membros do laboratório de Colas para discussões úteis e resenhas críticas do manuscrito. Este estudo foi suportado pelo NIH/NIEHS R44ES023521-02 e CIRM DISC2-10110 concede ao Dr. Colas.
Materials
| ACTC1 antibody | Sigma | A7811 | |
| Activin A | Stem Cell Technologies | Hu Recom Activin A | |
| Antibiotic Antimycotic (Anti-Anti) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| B27 supplement w/o – insulin | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 supplement w/o – vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587001 | |
| CDH5 antibody | R&D Systems | AF938 | |
| CryoStor CS10 | Stem Cell Technologies | 7930 | Cryopreservation reagent |
| DMEM high Glucose | Mediatech | 10-013-CV | |
| DPBS w/ Ca & Mg | Corning | 21-030-CV | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | |
| FBS | VWR | 89510-186 | |
| FluoVolt membrane potential kit | Thermo Fisher Scientific | F10488 | For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017 |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Matrigel, Growth Factor Reduced | Corning | 356231 | Coating reagent |
| mTeSR1 media kit | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| PBS w/o Ca & Mg | Corning | 21-040-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | ||
| Puromycin | Acros | 227422500 | |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | Enzyme-free dissociation reagent |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| TAGLN antibody | Abcam | ab14106 | |
| Thiazovivin | Stem Cell Technologies | 72254 | RHO/ROCK pathway inhibitor |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605 -010 | 1X enzyme-containing dissociation reagent |
| Tyrodes solution mix packets | Sigma | T2145-10X1L | (For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017) |
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