Generazione del primo cuore campo-come progenitori cardiaci e ventricolare-come cardiomiociti da cellule staminali pluripotenti umane
Summary
Qui descriviamo un metodo scalabile, usando una semplice combinazione di activina A e Id1-sovraespressione di lentivirus-mediata, per generare il primo cuore campo-come progenitori cardiaci e ventricolare-come cardiomiociti da cellule staminali pluripotenti umane.
Abstract
La generazione di grandi quantità di funzionale pluripotenti umane derivate da cellule staminali cardiache progenitori e cardiomiociti di origine campo definito cuore è un pre-requisito per la modellazione di malattia e di terapie basate su cellule cardiache. Abbiamo recentemente dimostrato che i geni di Id sono necessario e sufficiente per specificare i primi progenitori di campo cuore durante lo sviluppo dei vertebrati. Questo protocollo di differenziazione sfrutta questi risultati e utilizza Id1 sovraespressione in combinazione con activina A come potente specificando spunti per produrre prima dei progenitori (FHF-L) campo-come di cuore. D’importanza, progenitori risultanti differenziano in modo efficiente (~ 70 – 90%) in cardiomiociti ventricolari-come. Qui descriviamo un metodo dettagliato per 1) generare Id1-overexpressing hPSCs e 2) differenziare scalabile quantitativi di cryopreservable FHF-L progenitori e ventricolare-come cardiomiociti.
Introduction
Produzione su larga scala di cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs)-derivati progenitori cardiaci e nei cardiomyocytes è un pre-requisito per terapie basate sulle cellule staminali1, modellazione2,3 e la caratterizzazione rapida di malattia nuove vie che regolano il differenziamento cardiaco4,5,6 e fisiologia7,8. Sebbene un certo numero di studi9,10,11,12,13,14,15 precedentemente sono descritti altamente efficiente protocolli di differenziazione cardiache da hPSCs, nessuno ha affrontato l’origine del campo di cuore di cardiomiociti risultanti, nonostante l’identificazione delle differenze significative molecolare tra sinistra (primo campo del cuore) e destra (secondo campo del cuore) cardiomyocytes ventricolari16 e l’esistenza di malattie di cuore congenite cuore specifici del settore; cioè, cuore sinistro ipoplasico sindrome17 o aritmogena displasia ventricolare destra18. Così, la generazione dei progenitori cardiaci e cardiomiociti di origine campo cuore definito da hPSCs sta diventando una necessità al fine di aumentare la loro rilevanza come terapeutico e malattia strumenti di modellazione.
Questo protocollo si basa sulla sovraespressione costitutiva di Id1, recentemente identificato5 primo cuore campo specificando spunto che in combinazione con activina A, è necessario e sufficiente per avviare cardiogenesis in hPSCs. In particolare, Cunningham et al. (2017) 5 Visualizza che indotta da Id1 progenitori express specificamente primo campo del cuore (HCN4, TBX5) ma non secondo marcatori di campo di cuore (SIX2, ISL1) come subiscono differenziazione cardiaca. Inoltre, gli autori mostrano anche che gli embrioni di topo transgenico manca l’intera famiglia di Id dei geni (Id1–4), sviluppare senza formare prima cuore campo cardiaco dei progenitori, mentre più mediale e posteriore progenitori cardiaci ( secondo campo del cuore) può ancora formare, suggerendo così che Id proteine sono essenziali per avviare primo cuore cardiogenesis campo in vivo. Convenientemente, progenitori Id1-indotta possono essere crioconservati e spontaneamente differenziare in cardiomiociti visualizzazione ventricolare-come le caratteristiche, compreso l’espressione di marcatori specifici ventricolare (IRX4, MYL2) e ventricolare-come i potenziali di azione.
Qui descriviamo un metodo semplice e scalabile per generare il primo cuore campo-come (FHF-L) cardiaci progenitori e ventricolare-come cardiomiociti da hPSCs overesprimenti Id1. Una caratteristica importante di questo protocollo è la possibilità di disaccoppiare la generazione di cellule progenitrici cardiache da produzione del cardiomyocyte successive utilizzando un passaggio di crioconservazione conveniente. In sintesi, questo protocollo vengono illustrate le operazioni necessarie (1) generare Id1-overexpressing hPSCs, (2) generare progenitori cardiaci FHF-L da hPSCs, (3) crioconservare progenitori risultanti, e (4) riprendere la differenziazione di cellule progenitrici cardiache FHF-L e generare altamente arricchito (> 70 – 90%) battendo ventricolare-come cardiomiociti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per successo differenziazioni, assicurarsi di seguire attentamente le istruzioni elencate sopra. Inoltre, qui si evidenziano i parametri chiave che influenzano fortemente i risultati di differenziazione. Prima di iniziare una differenziazione, dovrebbero essere osservati i seguenti tre parametri morfologici: una morfologia di staminali di hPSCsId1, un’ad alta compattazione cellulare e una confluenza alta (> 90%) della cultura al giorno 0. A tale proposito, meglio si creano condizioni di differenziazione ottima…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i membri del laboratorio Colas per utili discussioni e recensioni critiche del manoscritto. Questo studio è stato sostenuto dalla NIH/NIEHS R44ES023521-02 e CIRM DISC2-10110 concede a Dr. Colas.
Materials
| ACTC1 antibody | Sigma | A7811 | |
| Activin A | Stem Cell Technologies | Hu Recom Activin A | |
| Antibiotic Antimycotic (Anti-Anti) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| B27 supplement w/o – insulin | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 supplement w/o – vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587001 | |
| CDH5 antibody | R&D Systems | AF938 | |
| CryoStor CS10 | Stem Cell Technologies | 7930 | Cryopreservation reagent |
| DMEM high Glucose | Mediatech | 10-013-CV | |
| DPBS w/ Ca & Mg | Corning | 21-030-CV | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | |
| FBS | VWR | 89510-186 | |
| FluoVolt membrane potential kit | Thermo Fisher Scientific | F10488 | For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017 |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Matrigel, Growth Factor Reduced | Corning | 356231 | Coating reagent |
| mTeSR1 media kit | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| PBS w/o Ca & Mg | Corning | 21-040-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | ||
| Puromycin | Acros | 227422500 | |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | Enzyme-free dissociation reagent |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| TAGLN antibody | Abcam | ab14106 | |
| Thiazovivin | Stem Cell Technologies | 72254 | RHO/ROCK pathway inhibitor |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605 -010 | 1X enzyme-containing dissociation reagent |
| Tyrodes solution mix packets | Sigma | T2145-10X1L | (For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017) |
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