Generation der ersten Herz Bereich-wie kardiale Stammväter und ventrikuläre wie Herzzellen aus menschlicher pluripotenter Stammzellen
Summary
Hier beschreiben wir eine skalierbare Methode mit einer einfachen Kombination von Activin A und Lentivirus-vermittelten Id1-Überexpression, erste Herz Bereich-wie kardiale Stammväter und ventrikuläre wie Herzzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen zu generieren.
Abstract
Die Generation der große Mengen von funktionalen menschlicher pluripotenter Stammzellen gewonnen kardiale Stammväter und Herzzellen definierten Herz Bereich Ursprungs ist eine wichtige Voraussetzung für kardiale Zelltherapien und Krankheit Modellierung. Wir haben kürzlich gezeigt, dass Id Gene notwendig und ausreichend, um erste Herz Bereich Vorfahren während der vertebrate Entwicklung angeben. Diese Differenzierung-Protokoll nutzt diese Erkenntnisse und nutzt Id1 Überexpression in Kombination mit Activin A als potente Angabe Hinweise, um erste Herz Bereich-wie (FHF-L) Vorfahren zu produzieren. Wichtig ist, differenzieren resultierende Stammväter ventrikuläre wie Kardiomyozyten effizient (~ 70 – 90 %). Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode, um (1) erzeugen Id1-überexprimierenden hPSCs und (2) skalierbare Mengen an cryopreservable FHF-L Stammväter und ventrikuläre wie Kardiomyozyten differenzieren.
Introduction
Produktion in großem Maßstab menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs)-abgeleitete kardialen Vorläuferzellen und Herzzellen ist eine wichtige Voraussetzung für stammzellbasierte Therapien1, Modellierung,2,3 und die schnelle Charakterisierung der Krankheit neuartige Wege zur Regulierung kardialen Differenzierung4,5,6 und Physiologie7,8. Obwohl eine Reihe von Studien9,10,11,12,13,14haben,15 zuvor beschriebenen hocheffiziente kardialen Differenzierung Protokolle von hPSCs, hat keiner den Herzen Feld Ursprung des daraus resultierenden Kardiomyozyten, trotz der Identifizierung von molekularen Unterschiede zwischen Links angesprochen (erste Herz-Feld) und rechts (zweites Herz-Feld) ventrikuläre Kardiomyozyten16 und die Existenz von Herzen feldspezifischen angeborene Herzerkrankungen; d. h. hypoplastischen Linksherz-Syndrom17 oder Arrhythmogenic rechtsventrikuläre Dysplasie18. So, die Generation der kardialen Vorläuferzellen und Herzzellen definierten Herz Feld Herkunft aus hPSCs werden immer eine Notwendigkeit, um ihre Relevanz als therapeutische zu erhöhen und Krankheiten Modellierungs-Tools.
Dieses Protokoll setzt auf die konstitutive Überexpression des Id1, ein neu identifizierte5 erste Herz Feld angeben Stichwort, das in Kombination mit Activin A, notwendig und ausreichend, um Cardiogenesis in hPSCs zu initiieren. Vor allem, Cunningham Et al. (2017) 5 zeigen, dass Id1-induzierte Stammväter speziell erste Herz-Feld (HCN4, TBX5) aber keine zweite Herz Feldmarken (SIX2, ISL1) Ausdrücken, wie sie kardialen Differenzierung zu unterziehen. Darüber hinaus zeigen die Autoren auch, dass transgene mausembryonen fehlt die ganze Id -Familie von Genen (Id1–4), zu entwickeln, ohne zu bilden erste Herz Bereich kardiale Stammväter, während mehr medialen und hinteren kardialen Vorläuferzellen ( zweites Herz-Feld) kann noch bilden, was darauf hindeutet, dass Id Proteine wichtig sind, erste Herz Feld Cardiogenesis in Vivozu initiieren. Bequem, Id1-induzierte Stammväter können kryokonserviert und spontan in Kardiomyozyten anzeigen ventrikuläre-ähnliche Merkmale, einschließlich der ventrikulären-spezifische Marker (IRX4, MYL2) Ausdruck zu unterscheiden und ventrikuläre wie Aktionspotentiale.
Hier beschreiben wir eine einfache und skalierbare Methode erste Herz Bereich-wie (FHF-L) kardiale Stammväter und ventrikuläre wie Herzzellen von Id1 überexprimierenden hPSCs zu erzeugen. Ein wichtiges Merkmal dieses Protokolls ist die Möglichkeit zur Erzeugung von kardialen Vorläuferzellen aus nachfolgenden Cardiomyocyte Produktion mit einer bequemen Kryokonservierung Schritt zu entkoppeln. Zusammenfassend lässt sich sagen dieses Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte (1) generieren Id1-überexprimierenden hPSCs, (2) generieren FHF-L kardialen Vorläuferzellen aus hPSCs, (3) resultierende Stammväter Tiefgefrieren und (4) wieder aufnehmen FHF-L kardialen Vorläuferzellen Differenzierung und generieren hochangereichertes (> 70 – 90 %) gegen ventrikuläre wie Kardiomyozyten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Achten Sie für erfolgreiche Differenzierungen darauf, eng oben aufgelisteten Anweisungen folgen. Darüber hinaus stellen wir hier wichtige Parameter, die Differenzierung Ergebnisse stark beeinflussen. Bevor Sie beginnen eine Differenzierung, die folgenden drei morphologische Parameter beachtet werden: ein Stamm Morphologie der hPSCsId1, eine hohe Verdichtung der zellulären und eine hohe Confluence (> 90 %) der Kultur an Tag 0. In dieser Hinsicht optimale Differenzierung Bedingungen entstehen am besten durch …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Mitglieder des Colas Lab für hilfreiche Diskussionen und Kritiken des Manuskripts. Diese Studie wurde unterstützt durch NIH/NIEHS R44ES023521-02 und CIRM DISC2-10110 räumt Dr. Colas.
Materials
| ACTC1 antibody | Sigma | A7811 | |
| Activin A | Stem Cell Technologies | Hu Recom Activin A | |
| Antibiotic Antimycotic (Anti-Anti) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| B27 supplement w/o – insulin | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 supplement w/o – vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587001 | |
| CDH5 antibody | R&D Systems | AF938 | |
| CryoStor CS10 | Stem Cell Technologies | 7930 | Cryopreservation reagent |
| DMEM high Glucose | Mediatech | 10-013-CV | |
| DPBS w/ Ca & Mg | Corning | 21-030-CV | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | |
| FBS | VWR | 89510-186 | |
| FluoVolt membrane potential kit | Thermo Fisher Scientific | F10488 | For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017 |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Matrigel, Growth Factor Reduced | Corning | 356231 | Coating reagent |
| mTeSR1 media kit | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| PBS w/o Ca & Mg | Corning | 21-040-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | ||
| Puromycin | Acros | 227422500 | |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | Enzyme-free dissociation reagent |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| TAGLN antibody | Abcam | ab14106 | |
| Thiazovivin | Stem Cell Technologies | 72254 | RHO/ROCK pathway inhibitor |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605 -010 | 1X enzyme-containing dissociation reagent |
| Tyrodes solution mix packets | Sigma | T2145-10X1L | (For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017) |
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