Generatie van eerste hart veld-achtige cardiale progenitoren en ventriculaire-achtige Cardiomyocytes van menselijke pluripotente stamcellen
Summary
Hier beschrijven we een schaalbare methode, met behulp van een eenvoudige combinatie van Activin A en lentivirus-gemedieerde Id1-overexpressie, voor het genereren van eerste hart veld-achtige cardiale progenitoren en ventriculaire-achtige cardiomyocytes van menselijke pluripotente stamcellen.
Abstract
De generatie van grote hoeveelheden van functionele menselijke pluripotente stamcellen cardiale voorlopercellen en cardiomyocytes van gedefinieerde hart veld oorsprong is een vereiste voor cel-gebaseerde cardiale therapieën en modellering van de ziekte. We hebben onlangs aangetoond dat Id genen zowel noodzakelijk zijn en voldoende om aan te geven van de eerste veld voorlopercellen van het hart tijdens de ontwikkeling van de gewervelde. Deze differentiatie-protocol maakt gebruik van deze bevindingen en Id1 overexpressie gebruikt in combinatie met Activin A potent opgeven signalen te produceren eerste hart veld-achtige (FHF-L) progenitoren. Bovenal differentiëren resulterende progenitoren efficiënt (~ 70-90%) in ventriculaire-achtige cardiomyocytes. Hier beschrijven we een gedetailleerde methode 1) worden gegenereerd Id1-overexpressing hPSCs en 2) schaalbare hoeveelheden cryopreservable FHF-L progenitoren en ventriculaire-achtige cardiomyocytes onderscheiden.
Introduction
Grootschalige productie van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs)-afgeleide cardiale progenitoren en cardiomyocytes is een eerste vereiste voor stamcel gebaseerde therapieën1, modelleren van2,3 en de snelle karakterisering van ziekte nieuwe trajecten regulering van de cardiale differentiatie4,5,6 en fysiologie7,8. Hoewel een aantal studies9,10,11,12,13,14hebben,15 eerder beschreven hoogefficiënte de protocollen van de cardiale differentiatie van hPSCs, geen heeft gericht de hart veld oorsprong van resulterende cardiomyocytes, ondanks de identificatie van moleculaire verschillen tussen links (eerste hart veld) en rechts (tweede hart-veld) ventriculaire cardiomyocytes16 en het bestaan van hart veld-specifieke aangeboren hartziekten; dat wil zeggen, hypoplastic linker hart syndroom17 of arrhythmogenic recht ventriculaire dysplasie18. Dus, de generatie van cardiale voorlopercellen en cardiomyocytes van gedefinieerde hart veld oorsprong van hPSCs wordt steeds een noodzaak teneinde hun relevantie als therapeutische en ziekte modeling tools.
Dit protocol is gebaseerd op de constitutieve overexpressie van Id1, een onlangs geïdentificeerde5 eerste hart veld-opgeven cue thats in combinatie met Activin A, noodzakelijk en voldoende zijn om te starten van cardiogenesis in hPSCs. Met name Cunningham et al. (2017) 5 Toon dat Id1-geïnduceerde progenitoren specifiek express eerste hart-veld (HCN4, TBX5) maar niet het tweede hart veld markeringen (SIX2, ISL1) als ze cardiale differentiatie ondergaan. Bovendien, tonen de auteurs ook dat transgene muis embryo’s ontbreekt de hele Id familie van genen (Id1–4), zonder dat zij eerste hart veld cardiale progenitorcellen, terwijl meer mediaal en posterieure cardiale progenitoren (vormen ontwikkelen tweede hart-veld) kan nog steeds vormen, waardoor suggereren dat Id eiwitten essentieel zijn voor het eerste hart veld cardiogenesis geactiveerd in vivo. Gunstig, Id1-geïnduceerde progenitoren kunnen worden cryopreserved en spontaan onderscheiden in cardiomyocytes ventriculaire-achtige kenmerken, met inbegrip van ventriculaire-specifieke markeringen (IRX4, MYL2) expressie weer te geven en ventriculaire-achtige actie potentieel.
Hier beschrijven we een eenvoudige en schaalbare methode voor het genereren van eerste hart veld-achtige (FHF-L) cardiale progenitoren en ventriculaire-achtige cardiomyocytes van Id1 overexpressing hPSCs. Een belangrijk kenmerk van dit protocol is de mogelijkheid om het afkoppelen van cardiale voorlopercellen generatie van latere cardiomyocyte productie met behulp van een handige cryopreservatie stap. Kortom, dit protocol gegevens de nodige maatregelen om (1) genereren Id1-overexpressing hPSCs, (2) genereren FHF-L cardiale progenitoren uit hPSCs (3) cryopreserve van de resulterende progenitoren en (4) hervatten FHF-L cardiale voorlopercellen differentiatie en genereren hoogverrijkt (> 70-90%) ventriculaire-achtige cardiomyocytes gewonnen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voor succesvolle differentiaties, zorg ervoor dat instructies boven op de voet volgen. Bovendien, markeren we hier sleutelparameters die differentiatie resultaten sterk te beïnvloeden. Voordat u begint een differentiatie, de volgende drie morfologische parameters moeten worden nageleefd: de morfologie van een stam van hPSCsId1, een hoge cellulaire verdichting en een hoge samenloop (> 90%) van de cultuur op dag 0. In dat opzicht optimale differentiatie voorwaarden zijn beste gemaakt door beplating los gezien h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de leden van de lab Colas voor nuttige discussies en kritieken van het manuscript. Deze studie werd ondersteund door de NIH/NIEHS R44ES023521-02 en CIRM DISC2-10110 verleent aan Dr. Colas.
Materials
| ACTC1 antibody | Sigma | A7811 | |
| Activin A | Stem Cell Technologies | Hu Recom Activin A | |
| Antibiotic Antimycotic (Anti-Anti) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| B27 supplement w/o – insulin | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 supplement w/o – vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587001 | |
| CDH5 antibody | R&D Systems | AF938 | |
| CryoStor CS10 | Stem Cell Technologies | 7930 | Cryopreservation reagent |
| DMEM high Glucose | Mediatech | 10-013-CV | |
| DPBS w/ Ca & Mg | Corning | 21-030-CV | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | |
| FBS | VWR | 89510-186 | |
| FluoVolt membrane potential kit | Thermo Fisher Scientific | F10488 | For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017 |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Matrigel, Growth Factor Reduced | Corning | 356231 | Coating reagent |
| mTeSR1 media kit | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| PBS w/o Ca & Mg | Corning | 21-040-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | ||
| Puromycin | Acros | 227422500 | |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | Enzyme-free dissociation reagent |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| TAGLN antibody | Abcam | ab14106 | |
| Thiazovivin | Stem Cell Technologies | 72254 | RHO/ROCK pathway inhibitor |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605 -010 | 1X enzyme-containing dissociation reagent |
| Tyrodes solution mix packets | Sigma | T2145-10X1L | (For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017) |
References
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
- Kodo, K., et al. iPSC-derived cardiomyocytes reveal abnormal TGF-beta signalling in left ventricular non-compaction cardiomyopathy. Nature cell biology. 18, 1031-1042 (2016).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494, 105-110 (2013).
- Colas, A. R., et al. Whole-genome microRNA screening identifies let-7 and mir-18 as regulators of germ layer formation during early embryogenesis. Genes & development. 26, 2567-2579 (2012).
- Cunningham, T. J., et al. Id genes are essential for early heart formation. Genes & development. , (2017).
- McKeithan, W. L., Colas, A. R., Bushway, P. J., Ray, S., Mercola, M. Serum-free generation of multipotent mesoderm (Kdr+) progenitor cells in mouse embryonic stem cells for functional genomics screening. Current protocols in stem cell biology. , 13 (2012).
- McKeithan, W. L., et al. An automated platform for assessment of congenital and drug-induced arrhythmia with hipsc-derived cardiomyocytes. Frontiers in physiology. 8, 766 (2017).
- Sharma, A., et al. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science translational medicine. 9, (2017).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature methods. 11, 855-860 (2014).
- Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell stem cell. 8, 228-240 (2011).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature biotechnology. 25, 1015-1024 (2007).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1848-1857 (2012).
- Willems, E., et al. Small molecule-mediated TGF-beta type II receptor degradation promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells. Cell stem cell. 11, 242-252 (2012).
- Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453, 524-528 (2008).
- Palpant, N. J., et al. Generating high-purity cardiac and endothelial derivatives from patterned mesoderm using human pluripotent stem cells. Nature protocols. 12, 15-31 (2017).
- DeLaughter, D. M., et al. Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development. Developmental cell. 39, 480-490 (2016).
- Liu, X., et al. The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome. Nature genetics. 49, 1152-1159 (2017).
- Corrado, D., Link, M. S., Calkins, H. Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy. New England journal of medicine. 376, 1489-1490 (2017).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Experimental hematology. 31, 1007-1014 (2003).
