Eine effiziente Vorbereitung Beispielmethode Kohlenhydrat Ionen-Signale in der Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung Massenspektrometrie verbessern
Summary
Ein Protokoll für die Verbesserung der Kohlenhydrat Ionen-Signale in der MALDI-Massenspektrometrie durch Reform kristallinen Strukturen während der Probe Herstellungsverfahren wird demonstriert.
Abstract
Probenvorbereitung ist ein kritischer Prozess in der Massenspektrometrie (MS) Analyse von Kohlenhydraten. Obwohl Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung (MALDI) MS ist die Methode der Wahl in Kohlenhydrat-Analyse, schlechte Ionen-Signale und Daten Reproduzierbarkeit der Kohlenhydrat-Proben weiterhin ernste Probleme. Für die Quantitative Analyse von Kohlenhydraten ist ein wirksames analytische Protokoll bietet überlegene Datenqualität erforderlich. Dieses Video zeigt Beispiel Vorbereitung Protokolle zur Verbesserung der Signalintensität und minimieren Datenabweichungen von Kohlenhydraten in MALDI-MS. Nach der Trocknung und Kristallisation der Probe Tröpfchen ist die Kristall-Morphologie von Methanol vor der massenspektrometrischen Analyse reformiert. Die Verbesserung in Kohlenhydrat-Signal wird mit MALDI bildgebende Massenspektrometrie (IMS) untersucht. Experimentelle Ergebnisse zeigen, dass Crystal Reformation Kristallstrukturen passt und Kohlenhydrat Analyten verteilt. Im Vergleich zu den getrockneten Tropfen Zubereitungsart in konventionellen MALDI-MS, Reform Kohlenhydrat Kristall Morphologien mit Methanol zeigt deutlich bessere Signalintensität, Ion Bildverteilung und Datenstabilität. Da die Protokolle hierin zeigte keine Veränderungen in der Probenzusammensetzung beinhalten, sind sie generell für verschiedene Kohlenhydrate und Matrizen.
Introduction
Kohlenhydrat-Analyse ist ein wichtiges und herausfordernden Thema. Kohlenhydrate und deren Derivate spielen eine wichtige Rolle lebenden Organismen1,2,3. Diese Moleküle haben komplizierte Strukturen und neigen dazu, zu zersetzen. Viele von ihnen können nicht eindeutig aufgrund von Schwierigkeiten bei der Trennung und Erkennung charakterisiert werden. Obwohl die Analyse einer Vielzahl von Biomolekülen, aufgrund seiner Sensibilität und nachvollziehbare Ergebnisse4, Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung (MALDI) Massenspektrometrie (MS) angewendet wurde weiter analysieren Kohlenhydrate mit MALDI-MS eine große Herausforderung aufgrund der niedrigen Ionisation Effizienz von solchen Molekülen5sein. Chemische Derivatisierung ist eine gängige Methode zur Verbesserung der Effizienz der Ionisation von Kohlenhydraten6,7, aber solche Verfahren sind Zeit und Probe zu konsumieren. Außerdem ist die Ionisation Effizienz derivatisierte Kohlenhydrate immer noch niedriger als die der Proteine. Somit ist die Entwicklung von Methoden zur Verbesserung der Kohlenhydrat-Signal im MALDI-MS ohne komplizierte Verfahren notwendig.
Die Anwendung von MALDI-MS, Quantitative Analyse ist ein weiteres anspruchsvolles Thema. Ein Hauptproblem der MALDI-MS ist, dass seine Sensibilität und Daten Reproduzierbarkeit kritisch auf Probe Vorbereitung Protokolle und experimentellen Parameter. In vielen Fällen ist die Quantitative Analyse von MALDI-MS aufgrund der heterogenen Stichprobe Morphologien und Analyten Verteilung unzuverlässig. Ein bekanntes Beispiel ist Proben mit einer 2,5-Dihydroxybenzoic Acid (DHB) MALDI-Matrix. Beim DHB langsam unter Umgebungsbedingungen kristallisiert ist, ist das Ausmaß der Analyten Einbindung in Matrix Kristalle unberechenbar, weil daraus resultierenden Proben unregelmäßige Morphologien zeigen. Solche Proben bestehen in der Regel von großen nadelförmig und feinen Kristallen. Beim DHB zubereitet ist eine flüchtige Lösungsmittel und/oder einen beheizten Probenteller, ergibt sich eine schnelle Trocknung in homogener feinen Kristallen und bessere quantitative Ergebnisse8,9,10. Diese Technik nennt man “Rekristallisation” MALDI Proben. Bessere Einbindung des Analyten in feinen Matrix Kristalle während der schnellen Kristallisation wird die Verbesserung zugeschrieben. Wir haben auch gezeigt, dass Vorbereitung Probenumgebung Anpassung die Heterogenität der Kohlenhydrat-Signal und verbesserte quantitative Ergebnisse11,12reduziert. Die Ergebnisse in diesen Werken legen nahe, dass die Probe Morphologie ist ein kritischer Faktor bei der Bestimmung der Kohlenhydrat-Signalqualität. Um eine allgemeine Strategie für tägliche Analyse zu entwickeln, ist eine effiziente Reformation Beispielmethode bietet verbesserte Kohlenhydrat Sensibilität erforderlich.
Wir haben die Korrelation zwischen Probe Morphologie und Kohlenhydrat Empfindlichkeit im MALDI-MS in den letzten Bericht13systematisch untersucht. Die erzielten Ergebnisse mit mehreren wichtigen Kohlenhydraten und Matrizen zeigen, dass die besten Signal-Verstärkung von recrystallizing erfüllt ist getrocknet MALDI Proben. Die Morphologie der Proben mit der konventionellen getrockneten Tropfen (DD) Methode ist durch schnelle Rekristallisation mit Methanol (MeOH) reformiert. Die detaillierte Beispiel Vorbereitung Protokolle werden hier demonstriert. Das Protokoll besteht aus drei wesentlichen Schritten, einschließlich Probe Platte Vorkonditionierung, Probe-Ablagerung und Rekristallisation und Massenspektrometrie Analyse. Die verwendeten Kohlenhydrate gehören Sialyl-Lewis (SLeA) und Maltoheptaose (MH). DHB wird als Modell Matrix verwendet. Die Ergebnisse zeigen, dass Kohlenhydrate Signalintensität und räumliche Verteilung nach Rekristallisation deutlich verbessert. Diese Methode kann auf Proben mit anderen beliebten Matrizen, einschließlich 2,4,6-Trihydroxyacetophenone (THAP) und α– Cyano-4-Hydroxycinnamic Säure angewendet werden. Diese Methode dient als eine allgemeine Ausrichtung, die leicht in der Labor-Routine für die Kohlenhydrat-Analyse integriert werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Probe Heterogenität ist ein entscheidendes Problem in der MALDI-MS. DD ist die am häufigsten verwendeten Probe Vorbereitung Methode, aber die daraus resultierende Kristalle sind sehr heterogen. Solche Beispiele zeigen schlechtes Signal von Schuss zu Schuss und Probe zu Probe Reproduzierbarkeit. Auf der Suche nach “Sweet Spots” in Probeflächen während der Datenerfassung ist daher, ein gemeinsames Vorgehen in MALDI-Experimente. Solchen heterogenen Proben sind ungeeignet für die Quantifizierung in Routineanalysen.
…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren haben keine Bestätigungen.
Materials
| Reagent | |||
| Detergent powder | Alconox | 242985 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Acetonitrile | Merck | 100003 | |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) | Alfa Aesar | A11459 | |
| sialyl-lewis A (SLeA) | Sigma-Aldrich | S1782 | |
| Maltoheptaose | Sigma-Aldrich | M7753 | |
| Pipette tips | Mettler Toledo | 17005091 | |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| Equipment | |||
| Milli-Q water purification system | Millipore | ZMQS6VFT1 | |
| Powder-free nitrile gloves | Microflex | SU-690 | |
| 600 mL beaker | Duran | 2110648 | |
| Ultrasonic cleaner | Delta | DC300H | |
| Hygrometer | Wisewind | 5330 | |
| Nitrogen gas flowmeter | Dwyer | RMA-6-SSV | |
| K-type thermocouples | Digitron | 311-1670 | |
| Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Mini centrifuge | Select BioProducts | Force Mini | |
| Pipette | Rainin | pipet-lite XLS | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Temperature controllable drying chamber | This lab | ||
| Ultraflex II TOF/TOF mass spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| MTP 384 target plate polished steel BC | Bruker Daltonics | 8280781 | |
| Flexcontrol Version 3.4 | Bruker Daltonics | Control software | |
| Fleximaging Version 2.1 | Bruker Daltonics | Imaging software | |
| Flexanalysis Version 3.4 | Bruker Daltonics | Analysis software |
References
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