Akış sitometresi ile su biyofilmler karakterizasyonu
Summary
Akış Sitometresi görsel kümeleme ile birlikte su biyofilmler çalışmak için kullanımı kolay ve hızlı bir yöntem sunar. Biyofilm karakterizasyonu, biyofilm toplum yapısındaki değişikliklerin tespiti ve biyofilm içinde gömülü abiyotik parçacıklar tespiti için kullanılabilir.
Abstract
Biyofilmler tatlı su ekosistemleri önemli bir rol oynamak dinamik konsorsiyumlar mikroorganizma, vardır. Onların toplum yapısını değiştirerek biyofilmler çevresel değişikliklere hemen tepki vermek ve böylece su kalitesi göstergeleri olarak kullanılabilir. Şu anda, biyofilm değerlendirme hangi bilgileri biyofilm toplum yapısına vermeyeceğini bütünleştirici ve fonksiyonel bitiş noktaları, etkinlik, fotosentetik veya solunum gibi çoğunlukla dayanmaktadır. Akış Sitometresi ve hesaplamalı görselleştirme topluluk bileşimi, tatlı su biyofilmler photoautotrophic parçası özellikle değerlendirilmesi için alternatif, hassas ve kullanımı kolay bir yöntem sağlar. Yalnızca temel numune hazırlama, sonra tüm örnek akış sitometresi ile çalıştığı gerektirir. Tek hücreli optik ve floresan bilgi Hesaplamalı görselleştirme ve biyolojik yorumu için kullanılır. Başlıca avantajları diğer yöntemler üzerinde analiz ve yüksek bilgi içerik doğa hızı vardır. Akış Sitometresi birkaç cep ve biyofilm özellikleri tek bir ölçüm üzerinde bilgi sağlar: parçacık boyutu, yoğunluk, pigment içeriği, abiyotik içeriğinde biyofilm ve kaba taksonomik bilgi. Ancak, bu bilgileri ilgili biyofilm kompozisyon türleri düzeyde sağlamaz. Biz çevre sucul ekosistemler izleme için yöntem kullanımındaki yüksek potansiyel görüyorum ve bir ilk biyofilm değerlendirme olarak aşağı bilgilendirir adım araştırmalar tamamlayıcı ve daha ayrıntılı yöntemlerle ayrıntılı.
Introduction
Tatlı su ekosistemleri, mikroorganizmalar ve onların biyolojik çeşitlilik ve ekosistem içinde dağılımını etkileyen birincil üretim, besin Bisiklete binme ve su arıtma arasında değişen önemli bir rol oynamaktadır dinamik konsorsiyumlar mikroorganizma, biyofilmler vardır 1. onların toplum yapısı hızla biyofilmler çevre koşulları değişen veya stresler, kimyasallar gibi maruz karşı daha hoşgörülü türler2,3vardiya. Geçerli yöntemlerden hiçbiri aslında bir biyofilm topluluk dinamik hızlı ve kolay bir şekilde izlemek için mükemmel uygundur ancak onların yüksek hassasiyet çevresel izleme4için çekici model sistemleri biyofilmler dönüşüyor.
Fonksiyonel ve yapısal bitiş noktaları ölçümü oluşan biyofilmler karakterize yöntemleri yaygın olarak kullanılan küme. Tüm toplum düzeyinde fotosentetik ve solunum aktivite yanı sıra ekstraselüler enzim aktivitesi sağlar bilgi biyofilm5,6,7,8 fonksiyonel durumunu ,9. Biyokütle tahakkuk genel biyofilm büyüme için bir göstergesi olarak kullanılır. Yapısal değişiklikler şu anda ya ışık mikroskobu ile veya nükleotid tabanlı teknikleri (degrade jel elektroforez (DGGE), otomatik ribozomal intergenic rondela denaturingÖrneğin, geleneksel tür kimliği kullanarak ölçülür Analizi (furkan), metagenomics)10,11,12. Bu yöntemler bilgi sağlar ama gerçekleştirmek, ya da belirli bilgi gerektirir zaman alıcı veya hala geliştiriliyor. Son olarak, hücre dışı polimer maddeler (EPS)13,14 ve biyofilm Mimarlık1, duyarlı, süre değerlendirilmesi için yeni yöntemler düşük işlem hacmi ve henüz doğru geliştirilmiştir değil izleme amacıyla.
Tatlı su biyofilmler tam karakterizasyonu için bu biyofilm işlevi, kompozisyon ve mimarisi hakkında bilgi sağlayan birkaç farklı yöntem birleştirmek için gerekli olduğunu belirgindir. Çevre kontrolü için öte yandan, biyofilm değişiklikleri algılayıp temel biyolojik yorumu orijinalinde fonksiyonel ve yapısal düzeyinde etkinleştirmek hızlı ve duyarlı Yöntem gereklidir.
Mikrobiyal topluluk karakterizasyonu için izleme amacıyla hızlı ve aynı zamanda biyofilm toplum üzerinde yeterli bilgi sağlayan akış biyofilmler (periphyton), Kemotrofik bileşen için yeni bir yöntem geliştirdik yapısı biyolojik yorumu15izin vermek için. Tek hücreli akış sitometresi biyofilm örnekleri üzerinde (FC) dayalı ve hesaplamalı görselleştirme ile birleştiğinde ve biyofilm tek hücre düzeyinde optik ve floresan özellikleri hakkında bilgi sağlar.
İş akışı biyofilm örnekleme sonra numune hazırlama sonication, fiksasyon ve örnek akış sitometresi tarafından değerlendirilmesi tarafından takip örneklerin boyutu tabanlı filtreleme şeklinde oluşur. Alınan veri tek bir ölçüm çeşitli hücresel özellikleri hakkında bilgi vermek: parçacık boyutu, yoğunluk, pigment içeriği, biyofilm abiyotik içeriği (Örneğin microplastics). Bu veri kümesini (viSNE)16hızlı ve kolay bir yorum veri sağlar, katıştırma visual Stokastik komşu kullanarak hesaplama görselleştirme ile analiz daha var. Bir kaç hafta ayarlamak ve yöntemi, en iyi duruma getirmek için gerekli olmasına rağmen bir kez kurmak, bu biyofilm örnekleri sonuçlarını yorumlama için toplanıyor sadece birkaç saat sürer.
Diğerleri sunulan yönteminin ana avantajları hızı yüksek-bilgi-içerik ve analiz edilmektedir. Ayrıca, örnekler koleksiyon floresans özellikleri ve onların optik kaybı olmadan sonra birkaç hafta saklanır. Çok sayıda örnekleri karakterizasyonu, biomonitoring program veya büyük örnekleme çalışmaları gibi gereklidir, ancak aynı zamanda önemli bir miktar daha küçük keşif çalışmaları bilgi sağlayabilir bu çok yararlı olabilir.
Sunulan Protokolü akış sitometrik analizinde bir akışı farklı konumlardan toplanan Kemotrofik biyofilmler (periphyton) temel alır. İletişim kuralı, Örneğin siteleri için izleme amacıyla, uygun seçimi birçok adım araştırma hedefleri üzerinde bağlıdır ve bu nedenle reçete olamaz. Diğerleri daha az özgürlük izin ve protokol yakından takip eder, bu açık ayrıntılı iletişim kuralında aşağıdaki yapılır gerektirir.
Protokol biyofilm tabanlı çevresel izleme siteleri seçimi ile başlar. Böylece onun ölçümleri biyofilmler izlenen ortamda yaşayan farklı Kemotrofik organizmalar arasında ayrımcılık etkinleştirmek sonraki adım için akış sitometresi (FC) düzmece. Bu sitelerden farklı türler mevcut biyofilm ve akış sitometresi lazer ve optik ölçüm, uygun etkinleştirmek filtreleri ayarlama floresan özelliklerini tanımlayan biyofilm örnekleri toplayarak yapılır dalga boylarında. FC set-up edildikten sonra biyofilmler olabilir siteleri düzenli olarak, optik ve floresan özellikleri tek parçacık akışı-sitometresi tarafından ölçülen biyofilm ve görsel kümeleme tarafından analiz veri mevcut toplanan. Sonuçlar daha iyi yorumlayabilmek için FC başvuru veritabanı, yerel biyofilm-canlı türlerine ve onların fenotipleri ve farklı Taksonomiler FC veri tanımlamak için veritabanını kullanmak mümkündür. Doğrulama floresans tabanlı tek hücre FACS ve taksonomik tanımlaması mikroskobu tabanlı mevcut türler kullanarak tanımlanan kümelerini sıralama yoluyla mümkündür. İletişim kuralının bir şematik resim 1‘ de verilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yukarıda açıklanan iletişim kuralı uygulamak oldukça kolaydır. Sunulan varsayılan ayarları tüm Kemotrofik biyofilm şimdiye kadar test için uygun olduğu gösterilmiştir, ancak, (iletişim kuralında tanımlandığı gibi) en iyi duruma getirme yönteminden elde ettiği bilgileri en üst düzeye çıkarmak için gerekli iken. Nitekim, biyofilmler optik ve floresan özelliklerini, çevre koşulları (sezon, sıcaklık, su kimyasal bileşimi)1bağlı olarak değişebilir. Bu nedenle, FC …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Sunulan iş SNF Ambizione Bursu (PZ00P2_142533) ve bir Velux Araştırma Bursu (Amplebig) tarafından desteklenmiştir. Bettina Wagner deneysel çalışma ile yardım için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Multimeter | WTW | MultiLine 3620 IDS | For measuring temperature, pH, dissolved oxygen |
| Ultrasonic cleaner | VWR International | 97043-986 | Tank dimesions: 15*14*10 cm |
| Flow cytometer | Beckman Coulter | Gallios | Lasers: 405, 488 and 638 nm. Filters bands in Supplementary Table 11. Sgier et, Nat Comm, 2016. |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 | used for selecting appropriate setting of the FC |
| Cell sorter | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | Settings in Supplementary Table 12. Sgier et, Nat Comm, 2016. |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert 135 | Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0.75 objective |
| SOFTWARE | |||
| Matlab | MathWorks | R2013a | software for numerical computing |
| CYT | Dana Pe'er Lab | Version 1.1 | free interactive visualization tool for analysis of cytometry data |
References
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Nat Rev Microbiol. 14 (4), 251-263 (2016).
- Rotter, S., Heilmeier, H., Altenburger, R., Schmitt-Jansen, M. Multiple stressors in periphyton – comparison of observed and predicted tolerance responses to high ionic loads and herbicide exposure. J Appl Ecol. 50 (6), 1459-1468 (2013).
- Tlili, A., et al. Pollution-induced community tolerance (PICT): towards an ecologically relevant risk assessment of chemicals in aquatic systems. Freshw Biol. 61 (12), 2141-2151 (2016).
- Lavoie, I., Lavoie, M., Fortin, C. A mine of information: Benthic algal communities as biomonitors of metal contamination from abandoned tailings. Science of the Total Environment. 425, 231-241 (2012).
- Tlili, A., Montuelle, B., Berard, A., Bouchez, A. Impact of chronic and acute pesticide exposures on periphyton communities. Sci Total Environ. 409 (11), 2102-2113 (2011).
- Dorigo, U., et al. Lotic biofilm community structure and pesticide tolerance along a contamination gradient in a vineyard area. Aquat Microb Ecol. 50 (1), 91-102 (2007).
- Pesce, S., et al. Evaluation of single and joint toxic effects of diuron and its main metabolites on natural phototrophic biofilms using a pollution-induced community tolerance (PICT) approach. Aquat Toxicol. 99 (4), 492-499 (2010).
- Ricart, M., et al. Effects of low concentrations of the phenylurea herbicide diuron on biofilm algae and bacteria. Chemosphere. 76 (10), 1392-1401 (2009).
- Martinez, A., Kominoski, J. S., Larranaga, A. Leaf-litter leachate concentration promotes heterotrophy in freshwater biofilms: Understanding consequences of water scarcity. Sci Total Environ. , 1677-1684 (2017).
- Corcoll, N., et al. Comparison of four DNA extraction methods for comprehensive assessment of 16S rRNA bacterial diversity in marine biofilms using high-throughput sequencing. Fems Microbiol Lett. 364 (14), (2017).
- Welsh, A. K., McLean, R. J. Characterization of bacteria in mixed biofilm communities using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Curr Protoc Microbiol. , (2007).
- Ranjard, L., et al. Characterization of bacterial and fungal soil communities by automated ribosomal intergenic spacer analysis fingerprints: Biological and methodological variability. Appl Environm Microbiol. 67 (10), 4479-4487 (2001).
- Stewart, T. J., Traber, J., Kroll, A., Behra, R., Sigg, L. Characterization of extracellular polymeric substances (EPS) from periphyton using liquid chromatography-organic carbon detection-organic nitrogen detection (LC-OCD-OND). Environ Sci Pollut R. 20 (5), 3214-3223 (2013).
- Kroll, A., et al. Mixed messages from benthic microbial communities exposed to nanoparticulate and ionic silver: 3D structure picks up nano-specific effects, while EPS and traditional endpoints indicate a concentration-dependent impact of silver ions. Environ Sci Pollut R. 23 (5), 4218-4234 (2016).
- Sgier, L., Freimann, R., Zupanic, A., Kroll, A. Flow cytometry combined with viSNE for the analysis of microbial biofilms and detection of microplastics. Nat Commun. 7, 11587 (2016).
- Amir el, A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nat Biotechnol. 31 (6), 545-552 (2013).
- Mora-Gomez, J., Freixa, A., Perujo, N., Barral-Fraga, L. Limits of the biofilm concept and types of aquatic biofilms. Aquatic Biofilms: Ecology, Water Quality and Wastewater Treatment. , 3-27 (2016).
- Matthaei, C. D., Guggelberger, C., Huber, H. Local disturbance history affects patchiness of benthic river algae. Freshw Biol. 48 (9), 1514-1526 (2003).
- Tlili, A., Hollender, J., Kienle, C., Behra, R. Micropollutant-induced tolerance of in situ periphyton: Establishing causality in wastewater-impacted streams. Water Res. 111, 185-194 (2017).
- Robinson, C. T., Rushforth, S. R. Effects of physical disturbance and canopy cover on attached diatom community structure in an idaho stream. Hydrobiologia. 154, 49-59 (1987).
- Pomati, F., Nizzetto, L. Assessing triclosan-induced ecological and trans-generational effects in natural phytoplankton communities: A trait-based field method. Ecotoxicology. 22 (5), 779-794 (2013).
- Hulliger, J. . Methoden zur Untersuchung und Beurteilung der Fliessgewässer. , (2007).
- Tlili, A., et al. In situ spatio-temporal changes in pollution-induced community tolerance to zinc in autotrophic and heterotrophic biofilm communities. Ecotoxicology. 20 (8), 1823-1839 (2011).
- Foladori, P., Laura, B., Gianni, A., Giuliano, Z. Effects of sonication on bacteria viability in wastewater treatment plants evaluated by flow cytometry – Fecal indicators, wastewater and activated sludge. Water Res. 41 (1), 235-243 (2007).
- Buesing, N., Gessner, M. O. Comparison of detachment procedures for direct counts of bacteria associated with sediment particles, plant litter and epiphytic biofilms. Aquat Microb Ecol. 27 (1), 29-36 (2002).
- van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing Data using t-SNE. J Mach Learn Res. 9, 2579-2605 (2008).
- van der Maaten, L. Accelerating t-SNE using Tree-Based Algorithms. J Mach Learn Res. 15, 3221-3245 (2014).
