フローサイトメトリーによる水生バイオ フィルムの特性
Summary
視覚的クラスタ リングと組み合わせてフローサイトメトリー水生バイオ フィルムを研究するための使いやすい高速メソッドを提供しています。バイオ フィルムの特性評価、バイオ フィルムのコミュニティ構造の変化の検出とバイオ フィルムに埋め込まれた非生物的微粒子の検出に使用できます。
Abstract
バイオ フィルムは、淡水の生態系で重要な役割を再生する微生物の動的のコンソーシアムです。彼らのコミュニティの構造を変更すると、バイオ フィルムは環境の変化に迅速に対応、水質の指標としてこうして使用することができます。現在、バイオ フィルムの評価はほとんど統合的で機能的なエンドポイントに基づいて、光合成や呼吸の活動などバイオ フィルムのコミュニティの構造に関する情報を提供していません。フローサイトメトリーと計算可視化、淡水のバイオ フィルムの培養部で特に、群集組成の評価のための代替、機密性の高い、使いやすいメソッドを提供しています。流れの cytometer を介して全体のサンプルを実行する後にのみ基本的なサンプル準備が必要です。単一セルの光と蛍光の情報は、計算可視化と生物学的解釈のため使用されます。他の方法でその主な利点は、解析と高情報内容自然の速度です。フローサイトメトリーは 1 回の測定で複数の細胞とバイオ フィルム特性に関する情報を提供します: 粒子サイズ、密度、色素含有量、バイオ フィルム、および粗い分類情報の非生物的コンテンツ。ただし、種レベルでのバイオ フィルム構成の情報は提供しません。水生生物の生態系の環境を監視するためのメソッドの使用方法の可能性が高いと下流に通知手順初期バイオ フィルム評価として補完的でより詳細な方法で調査の詳細についています。
Introduction
バイオ フィルムは微生物や生態系における生物多様性の分布に影響を与える第一次生産、栄養循環や水の浄化に至る、淡水の生態系で重要な役割を再生する微生物の動的コンソーシアム1。 彼らのコミュニティの構造がより寛容種2,3に向けて迅速にシフト バイオ フィルムは化学薬品、ストレス、環境の変化にさらされているとき。感度が高くは、しかし、現在の方法のどれも実際に迅速かつ簡単な方法でバイオ フィルムのコミュニティのダイナミックをトレースに最適です環境監視4、魅力的なモデル システムにバイオ フィルムを回します。
一般的に使用される一連のバイオ フィルムを特徴付けるメソッドは機能的及び構造的エンドポイントの測定から成っています。社会全体のレベルで細胞外酵素の活動と同様、光合成と呼吸の活動情報を提供バイオ5,6,7,8 の機能の状態に ,9。バイオマスの発生は全体的なバイオ フィルムの成長の指標として使用されます。構造変更現在測定顕微鏡またはヌクレオチド ベースの技術 (例えば、勾配ゲル電気泳動法 (dgge 法)、自動化されたリボソーム遺伝子間スペーサーを変化させる伝統的な種の同定を使用してのいずれかメタゲノム解析 (アリサ))10、11,12。これらのメソッドは、情報を提供するが、特定の知識を必要とする、または実行に時間がかかり、またはまだ開発中でいます。最後に、新しい細胞外高分子物質 (EPS)13,14とバイオ アーキテクチャの1、敏感な中評価法低スループットし、に向かって開発されていません。監視の目的。
淡水のバイオ フィルムの完全な特性評価、それはバイオ フィルムの機能、構成とアーキテクチャに洞察力を提供するいくつかの異なる方法を組み合わせる必要は明らかです。環境モニタリングのため、他の一方で、バイオ フィルムの変化を検出し、機能と構造のレベルでシフトの基本的な生物学的解釈を有効にすることができる高速で機密性の高いメソッドが必要です。
監視目的のため、十分に高速であり同時にバイオ フィルムのコミュニティのための十分な情報を提供します。 ストリームのバイオ フィルム (河床) の光合成のコンポーネントの微生物群集特性に対する新しい方法を開発しています。15生物学的解釈を許容する構造。それは単一セル フローサイトメトリー (FC) バイオ フィルムのサンプルに基づいており、計算可視化と相まって単一セルのレベルのバイオ フィルムの光や蛍光灯の特性に関する情報を提供します。
バイオ フィルムのサンプリング後のワークフローは、超音波処理、固定とフローサイトメトリーによるサンプルを評価することによって続いてサンプルのサイズに基づくフィルタ リングの形態の試料で構成されます。取得したデータは、1 回の測定で複数の細胞特性の情報: 粒子サイズ、密度、色素含有量バイオ フィルム中の非生物的コンテンツ (例: microplastics)。このデータ セットは埋め込み (viSNE)16データの高速かつ簡単な解釈を可能にする視覚的確率的近傍を用いた計算可視化分析よりも。設定し、メソッドを最適化する数週間が必要ですセットアップ後、結果の解釈にバイオ フィルム サンプルを収集からほんの数時間がかかります。
他のものより本手法の主な利点は、解析と高情報内容の速度です。また、数週間後にその光の損失と蛍光特性なしコレクション サンプルを保存ことができます。これは、サンプル数が多いが大規模なサンプリング研究やバイオモニタ リングなど、必要なが大量の探索的研究小規模で情報を提供することも非常に便利です。
提案するプロトコルは、ストリームのさまざまな場所から収集された光合成バイオ フィルム (河床) の流れフローサイトメトリー分析に基づいています。プロトコル、例えば監視目的のため、適切なサイトの選択の多くの手順は、研究の目標に依存し、処方することが。その他はより少ない自由を許可する、プロトコルが密接に続いているこれは詳細なプロトコルの下で明らかにされてする必要が。
プロトコルは、バイオ フィルムを用いた環境モニタリングのためのサイトの選択から始まります。次のステップは、その測定監視環境でバイオ フィルムに住んでいる異なった光合成有機体の識別を有効にするを設定する流れの cytometer (FC) です。これは種バイオ フィルムと流れの cytometer レーザーと光で測定を有効にするとフィルター設定に存在の蛍光特性を識別するサイトからバイオ フィルムのサンプルを収集することにより実行されます。波長です。バイオ フィルムができる FC をセットアップした後、定期的に、フローサイトメトリーを用いてバイオ フィルムと視覚的クラスタ リングによって分析されたデータに存在する単一粒子の光と蛍光特性のサイトから収集します。結果の解釈、FC のリファレンス ・ データベースはローカルのバイオ生物種とその表現を構築し、FC データで別の分類を識別するためにデータベースを使用可能です。検証は、FACS、本種の分類同定を顕微鏡ベースを使用して単一セルの特定のクラスターの蛍光ベースの並べ替えを介して可能です。プロトコルの概略は、図 1で与えられます。
Protocol
Representative Results
Discussion
上記で説明したプロトコルは比較的簡単に実装です。しかし、提示された既定の設定がすべて光合成バイオ フィルムはこれまでテストに適していることが示されている、(プロトコルで説明) の最適化はメソッドから得られる情報を最大限に必要です。確かに、バイオ フィルムの光と蛍光特性環境条件 (季節、温度、水の化学組成)1によって異なることができます。そのため?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
提示された作品は、SNF Ambizione 親睦 (PZ00P2_142533) とベルックス研究助成 (Amplebig) によって支えられました。については実験的な作品をベティーナ ワーグナーに感謝したいと思います。
Materials
| Multimeter | WTW | MultiLine 3620 IDS | For measuring temperature, pH, dissolved oxygen |
| Ultrasonic cleaner | VWR International | 97043-986 | Tank dimesions: 15*14*10 cm |
| Flow cytometer | Beckman Coulter | Gallios | Lasers: 405, 488 and 638 nm. Filters bands in Supplementary Table 11. Sgier et, Nat Comm, 2016. |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 | used for selecting appropriate setting of the FC |
| Cell sorter | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | Settings in Supplementary Table 12. Sgier et, Nat Comm, 2016. |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert 135 | Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0.75 objective |
| SOFTWARE | |||
| Matlab | MathWorks | R2013a | software for numerical computing |
| CYT | Dana Pe'er Lab | Version 1.1 | free interactive visualization tool for analysis of cytometry data |
References
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