Caratterizzazione di biofilm acquatici con citometria a flusso

I biofilm sono consorzi dinamici del microorganismo che svolgono un ruolo chiave negli ecosistemi d’acqua dolce, che vanno dalla produzione primaria, ciclo dei nutrienti e purificazione dell’acqua ad influenzare la distribuzione dei microrganismi e della loro biodiversità nell’ecosistema ¹. quando biofilm sono esposti a condizioni ambientali o a fattori di stress, quali i prodotti chimici, la loro struttura di comunità si sposta rapidamente verso più tollerante specie^2,3. Loro alta sensibilità si trasforma il biofilm in sistemi modello attraente per monitoraggio ambientale⁴, tuttavia nessuno dei metodi attualmente è perfettamente adatto per tracciare effettivamente la dinamica di una comunità di biofilm in un modo facile e veloce.

Il comunemente utilizzato set di metodi per la caratterizzazione di biofilm consiste nella misurazione di endpoint funzionale e strutturale. A livello dell’intera comunità, l’attività fotosintetica e respiratoria, nonché l’attività degli enzimi extracellulari fornisce informazioni sullo stato funzionale del biofilm^{5,6,7,8 ,9}. Attribuzione di biomassa viene utilizzato come un indicatore per la crescita complessiva del biofilm. Cambiamenti strutturali sono attualmente misurate sia tramite identificazione di specie tradizionali con microscopia chiara o con tecniche basate su nucleotide (ad es., denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), distanziale intergenica ribosomale automatizzato analisi (ARISA), metagenomica)^10,11,12. Questi metodi forniscono informazioni ma sono richiede molto tempo per eseguire, o richiedono conoscenze specifiche o sono ancora in fase di sviluppo. Infine, nuovi metodi per la valutazione delle sostanze polimeriche extracellulari (EPS)^13,14 e il biofilm architettura¹, mentre sensibile, sono basso-throughput e non sono state ancora sviluppate verso a fini di controllo.

È evidente che per una completa caratterizzazione di biofilm d’acqua dolce, è necessario combinare diversi metodi, che consentono di comprendere la funzione di biofilm, la composizione e l’architettura. Per il monitoraggio ambientale, d’altra parte, un metodo veloce e sensibile che è in grado di rilevare le modifiche nel biofilm e abilitare base interpretazione biologica dei mutamenti a livello strutturale e funzionale è necessario.

Abbiamo sviluppato un nuovo metodo per la caratterizzazione della comunità microbica del componente phototrophic di flusso biofilm (perifiton), che è abbastanza veloce per fini di controllo e allo stesso tempo fornisce sufficienti informazioni sulla comunità di biofilm struttura per consentire l’interpretazione biologica¹⁵. Si basa su singola cellula flusso cytometry (FC) di campioni di biofilm ed accoppiato con visualizzazione computazionale e fornisce informazioni sulle proprietà ottiche e fluorescente del biofilm a livello di singola cellula.

Il flusso di lavoro dopo il biofilm campionamento consiste di preparazione del campione sotto forma di sonicazione, fissazione e filtraggio basato sulle dimensioni dei campioni seguiti da valutare il campione tramite flusso cytometry. I dati acquisiti forniscono informazioni sulle caratteristiche cellulari diversi in una singola misurazione: granulometria, densità, contenuto di pigmenti, abiotici contenuti (ad es. microplastiche) nel biofilm. Questo set di dati è che analizzati tramite visualizzazione computazionale utilizzando visual stocastico prossimo incorporamento (viSNE)¹⁶, che consente il veloce e facile interpretazione dei dati. Anche un paio di settimane è necessario configurare e ottimizzare il metodo, una volta impostato, ci vogliono solo poche ore dalla raccolta dei campioni di biofilm per l’interpretazione dei risultati.

I principali vantaggi del metodo presentato sopra gli altri sono la velocità di analisi e di alto contenuto di informazioni. Inoltre, i campioni possono essere conservati per diverse settimane dopo la raccolta senza perdita di loro ottica e proprietà di fluorescenza. Questo può essere molto utile quando è richiesto, ad esempio campionamento grandi studi o programmi di biomonitoraggio caratterizzazione di un gran numero di campioni, ma può anche fornire una notevole quantità di informazioni in più piccoli studi esplorativi.

Il protocollo presentato si basa sull’analisi cytometric di flusso, di phototrophic biofilm (perifiton), raccolto da diversi punti di un flusso. Molti passaggi del protocollo, ad esempio la selezione di siti appropriati per il monitoraggio, dipendono gli obiettivi della ricerca e pertanto non possono essere prescritto. Altri consentono meno libertà e richiedono che il protocollo è seguito da vicino, ciò è reso chiaro nel protocollo dettagliato qui sotto.

Il protocollo inizia con la selezione dei siti per il monitoraggio ambientale basato su biofilm. Il passo successivo è quello di set-up il citometro a flusso (FC) così che le sue misure permettono discriminazione tra diversi organismi phototrophic vivono in biofilm nell’ambiente monitorato. Questa operazione viene eseguita attraverso la raccolta di campioni di biofilm dai siti, identificare le proprietà fluorescenti di diverse specie presenti nel biofilm e configurando il citometro a flusso con filtri che permettono la misurazione del ottico e laser lunghezze d’onda. Una volta che la FC è stato istituito, i biofilm possono essere raccolti dai siti periodicamente, le proprietà ottiche e fluorescente delle singole particelle presenti nel biofilm misurata da citometria a flusso e i dati analizzati dal clustering visual. Per la migliore interpretazione dei risultati, è possibile costruire un database di riferimento FC di specie locali di biofilm-vivente e loro fenotipi e utilizzare il database per identificare differenti tassonomie nei dati FC. La convalida è possibile attraverso l’ordinamento basato su fluorescenza dei cluster individuati di singole cellule mediante FACS e basati su microscopia identificazione tassonomica delle specie presenti. Un disegno schematico del protocollo è dato in Figura 1.