אפיון Biofilms ימיים עם Cytometry זרימה

Biofilms הם קונסורציומים דינמי של מיקרואורגניזם לשחק תפקיד מפתח מערכות אקולוגיות מים מתוקים, החל הייצור הראשוני, רכיבה על אופניים מזין, טיהור מים המשפיעים על ההתפלגות של מיקרואורגניזמים, שלהם הביולוגי של המערכת האקולוגית ¹. כאשר biofilms חשופים לתנאי הסביבה המשתנים או לחצים, כגון כימיקלים, מבנה הקהילה שלהם משתנה במהירות כלפי מינים יותר סובלנית^2,3. רגישות גבוהה שלהם הופכת biofilms מודל אטרקטיבי מערכות ניטור סביבתי⁴, אולם אף אחת משיטות הנוכחי מתאים באופן מושלם לאתר למעשה את הדינמיקה של קהילה biofilm בצורה קלה ומהירה.

ערכת נפוץ של שיטות לאפיון biofilms מורכב המדד של נקודות קצה תפקודית ומבניים. ברמה של הקהילה כולה, פעילות פוטוסינתטיים, מערכת הנשימה, כמו גם הפעילות של אנזימים חוץ-תאית מספק מידע אודות למצב התפקודי של biofilm^{5,6,7,8 ,9}. התשלום של ביומסה משמש כמחוון לצמיחה biofilm הכללית. שינויים מבניים נמדדים כיום גם על ידי שימוש לזן מסורתי עם מיקרוסקופ אור או עם טכניקות מבוססות נוקלאוטיד (למשל, denaturing הדרגתיות בג’ל (DGGE), מרווח intergenic ribosomal אוטומטיות ניתוח (ARISA), metagenomics)^10,11,12. שיטות אלה מספקים מידע אבל הם זמן רב לביצוע, או דורשים ידע ספציפי, או נמצאים עדיין בשלבי פיתוח. לבסוף, שיטות חדשות על ההערכה של^13,חוץ-תאית חומרים פולימריים (EPS)¹⁴ , biofilm אדריכלות¹, תוך רגישות, תפוקה נמוכה, לא פותחו עדיין כלפי למטרות ניטור.

זה ניכר כי עבור אפיון מלא של מים מתוקים biofilms, יש צורך לשלב מספר שיטות שונות, אשר מספקים תובנה biofilm פונקציה, הרכב ואת הארכיטקטורה. עבור ניטור סביבתי, מצד שני, שיטה מהירה רגיש כי הוא מסוגל לזהות שינויים biofilm ולאפשר הפירוש הביולוגי הבסיסי משמרות ברמה תפקודית ומבניים נדרש.

פיתחנו שיטה חדשה עבור הקהילה מיקרוביאלי אפיון של הרכיב phototrophic של זרם biofilms (periphyton), אשר מהיר מספיק למטרות ניטור, באותו זמן מספק מספיק מידע על קהילת biofilm מבנה כדי לאפשר פרשנות ביולוגי¹⁵. בהתבסס על cytometry זרימה בתא יחיד (FC) דוגמאות biofilm, בשילוב עם ויזואליזציה חישובית ומספק מידע על מאפיינים אופטיים, פלורסנט של biofilm ברמה תא בודד.

זרימת העבודה לאחר דגימה biofilm כוללת הכנת הדוגמא בדמות sonication, קיבוע, המבוססת על גודל סינון של הדגימות ואחריו הערכת המדגם על ידי cytometry זרימה. הנתונים שהושגו לספק מידע על מספר תכונות הסלולר במידה יחיד: גודל החלקיקים, צפיפות, פיגמנט תוכן, תוכן והאביוטיים (למשל microplastics) biofilm. קבוצת נתונים זו הינו מ נותחו באמצעות ויזואליזציה חישובית באמצעות חזותי השכן סטוכסטי הטבעה (viSNE)¹⁶, אשר מאפשרת פרשנות קלה ומהירה של הנתונים. למרות כמה שבועות נדרשים להגדיר ולשפר את השיטה, לאחר ההגדרה, זה לוקח רק כמה שעות של איסוף הדגימות biofilm לפרש את התוצאות.

היתרונות העיקריים של שיטת שהוצגו על פני האחרים הם המהירות של ניתוח גבוהה-מידע-תוכן. יתר על כן, ניתן לאחסן את הדגימות למשך מספר שבועות אחרי אוסף ללא אובדן שלהם אופטי ומאפיינים זריחה. זה יכול להיות שימושי מאוד בעת אפיון של מספר רב של דוגמאות נדרש, כגון מחקרים דגימה גדולה או תוכניות אפידמיולוגיה סביבתית, אך יכול גם לספק כמות משמעותית של מידע קטן גישוש במחקרים.

פרוטוקול הציג מבוסס על ניתוח תזרים-cytometric של biofilms phototrophic (periphyton) שנאספו ממקומות שונים של זרם. שלבים רבים של הפרוטוקול, למשל מבחר אתרים המתאימים למטרות, ניטור תלויים מטרות המחקר, ולכן לא יכול שייקבעו. אחרים מאפשרים פחות חופש ודורשים כי הפרוטוקול מלווה מקרוב, זה נעשה ברור בפרוטוקול מפורט להלן.

הפרוטוקול מתחיל עם המבחר של אתרים מבוססי biofilm ניטור סביבתי. השלב הבא הוא שיבנו הזרימה-cytometer (FC) כך המידות שלה לאפשר אפליה בין אורגניזמים שונים phototrophic המתגוררים biofilms בסביבת תחת פיקוח. זה מבוצע על ידי איסוף דגימות biofilm מן האתרים, זיהוי מאפייני מינים שונים נוכח את biofilm והגדרת את הזרימה-cytometer עם לייזרים ומסננים המאפשרים מדידה ב המתאים אופטי פלורסנט אורכי גל. ברגע מועדון הכדורגל כבר הגדרת, biofilms יכול להיות שנאספו מן האתרים מעת לעת, המאפיינים אופטי ו פלורסנט של החלקיקים יחיד נוכח את biofilm נמדדת cytometry זרימה, ואת הנתונים נותחו על ידי קיבוץ באשכולות חזותי. לפרשנויות טוב יותר של התוצאות, זה אפשרי לבנות מסד נתונים הפניה FC של המינים biofilm-החיים המקומי, פנוטיפים שלהם, להשתמש במסד הנתונים לזיהוי מיונים שונים בנתוני ה-FC. אימות הוא אפשרי דרך המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית מיון האשכולות מזוהה של תאים בודדים באמצעות FACS מבוסס מיקרוסקופיה זיהוי טקסונומי של המין האנושי הנוכחי. תיאור סכמטי של הפרוטוקול ניתנת באיור1.