Charakterisierung der aquatischen Biofilme mit Durchflusszytometrie

Biofilme sind dynamische Konsortien von Mikroorganismen, die eine in Süßwasser-Ökosystemen, Primärproduktion Schlüsselrolle, nährstoffkreisläufe und Wasseraufbereitung bis hin zu beeinflussen die Verteilung der Mikroorganismen und ihrer Artenvielfalt des Ökosystems ¹. wenn Biofilme an sich verändernde Umweltbedingungen oder Stressoren, wie Chemikalien, ausgesetzt sind rückt die Gemeinschaftsstruktur schnell toleranter Arten^2,3. Ihre hohe Empfindlichkeit verwandelt sich Biofilme in attraktive Modellsysteme für ökologische Überwachung⁴, jedoch keine der aktuellen Methoden perfekt geeignet ist, um die Dynamik einer Biofilm-Gemeinschaft tatsächlich in eine schnelle und einfache Weise zu verfolgen.

Die häufig verwendete Satz von Methoden zur Charakterisierung von Biofilmen besteht aus der Messung der funktionellen und strukturellen Endpunkte. Auf der Ebene der gesamten Gemeinschaft enthält Photosynthese und Atmung sowie die Aktivität extrazellulärer Enzyme Informationen über den Funktionszustand der Biofilm^{5,6,7,8 ,9}. Biomasse-Abgrenzung dient als Indikator für Gesamtwachstum Biofilm. Strukturelle Veränderungen sind derzeit entweder mit traditionellen speziesidentifizierung mit Lichtmikroskopie oder Nukleotid-basierte Techniken (z.B.Denaturierenden Gradienten Gelelektrophorese (DGGE), automatisierte ribosomale intergenetischer Distanzstück gemessen. Analyse (ARISA), Metagenomik)^10,11,12. Diese Methoden informieren, sondern sind zeitaufwendig, durchzuführen, oder erfordern spezielle Kenntnisse oder sind noch in der Entwicklungsphase. Schließlich neue Methoden zur Bewertung der extrazelluläre Polymere Substanzen (EPS)^13,14 und der Biofilm Architektur¹, während der empfindlichen, sind niedrig-Durchsatz und noch nicht in Richtung entwickelt worden Überwachungszwecke.

Es ist offensichtlich, dass für eine vollständige Charakterisierung von Süßwasser Biofilmen, es notwendig ist, verschiedene Methoden, die Einblick in die Biofilm-Funktion, die Zusammensetzung und die Architektur zu kombinieren. Für die Umweltüberwachung, auf der anderen Seite ist eine schnelle und empfindliche Methode, die ist erkennen Veränderungen im Biofilm und ermöglichen grundlegende biologische Deutung der Verschiebungen auf die funktionellen und strukturellen Ebene, erforderlich.

Wir haben eine neue Methode zur Charakterisierung der mikrobiellen Gemeinschaft der phototrophe Komponente von Stream Biofilmen (Periphyton), entwickelt, ist schnell genug für Überwachungszwecke und gleichzeitig ausreichend informiert über den Biofilm-Gemeinschaft Struktur, biologische Deutung¹⁵zu ermöglichen. Es basiert auf einzellige Durchflusszytometrie (FC) der Biofilm Proben und gepaart mit computergestützten Visualisierung und bietet Informationen über optische und fluoreszierende Eigenschaften des Biofilms auf der Ebene der einzelnen Zelle.

Der Workflow nach der Probenahme Biofilm besteht der Probenvorbereitung in Form von Beschallung, Fixierung und Größe-basierte Filterung der Proben, gefolgt von der Beurteilung der Probenmaterials durch Durchflusszytometrie. Die erfassten Daten geben Auskunft über mehrere zellulären Eigenschaften in einer einzigen Messung: Partikelgröße, Dichte, Pigmentanteil, abiotische Inhalte (z. B. mikroplastik) im Biofilm. Dieser Satz von Daten ist als über computergestützte Visualisierung mit visuellen stochastische Nachbar einbetten (ViSNE)¹⁶, ermöglicht schnelle und einfache Interpretation der Daten analysiert. Obwohl ein paar Wochen erforderlich sind, um einrichten und optimieren die Methode einmal eingerichtet, es dauert nur wenige Stunden von den Biofilm Probenahmen zur Interpretation der Ergebnisse.

Die wichtigsten Vorteile der vorgestellten Methode gegenüber anderen sind die Geschwindigkeit der Analyse und hohen Informationsgehalt. Darüber hinaus können die Proben für mehrere Wochen nach der Entnahme ohne Verlust von ihren optischen und Fluoreszenzeigenschaften gespeichert werden. Dies kann sehr nützlich sein bei der Charakterisierung von einer großen Anzahl von Proben ist erforderlich, wie z. B. große Stichproben Studien oder Biomonitoring-Programme, sondern bieten auch eine beträchtliche Menge an Informationen in kleinere explorative Studien.

Die vorgestellte Protokoll basiert auf Fluss-durchflusszytometrischen Analyse von phototrophe Biofilmen (Periphyton) von verschiedenen Standorten eines Baches gesammelt. Viele Schritte des Protokolls, z. B. die Auswahl der Standorte für Überwachungszwecke, die Ziele der Forschung abhängig und daher können nicht verordnet werden. Andere weniger Freiheit ermöglichen und erfordern, dass das Protokoll aufmerksam verfolgt, wird in das ausführliche Protokoll unten deutlich.

Das Protokoll beginnt mit der Auswahl der Standorte für Biofilm-basiertes Umweltmonitoring. Der nächste Schritt ist Setup Durchflusszytometer (FC), so dass seine Messungen Diskriminierung zwischen verschiedenen phototrophe Organismen in Biofilmen in der überwachten Umgebung ermöglichen. Dies erfolgt durch das Sammeln von Biofilm-Proben von den Sites, identifizieren die fluoreszierenden Eigenschaften der verschiedenen Arten in den Biofilm und Einrichten der Durchflusszytometer mit Laser und Filter, die Messung an den entsprechenden optischen aktivieren Wellenlängen. Nachdem die FC Aufbau wurde, können Biofilme werden gesammelt von den Seiten in regelmäßigen Abständen die optischen und fluoreszierenden Eigenschaften der einzelnen Partikel in den Biofilm-Durchflusszytometrie gemessen und die Daten analysiert durch visuelle clustering. Für bessere Interpretation der Ergebnisse ist es möglich, eine FC-Referenzdatenbank von lokalen Biofilm-Lebewesen und ihre Phänotypen zu bauen und die Datenbank verwenden, um verschiedene Taxonomien in den FC-Daten zu identifizieren. Die Validierung ist möglich durch Fluoreszenz basierende Sortierung der identifizierten Cluster von Einzelzellen mit FACS und Mikroskopie-basierte taxonomische Identifizierung der vorliegenden Art. Eine schematische Darstellung des Protokolls ist in Abbildung 1aufgeführt.