Caractérisation des Biofilms aquatiques avec écoulement Cytometry

Les biofilms sont des consortiums dynamiques des micro-organismes qui jouent un rôle clé dans les écosystèmes d’eau douce, allant de la production primaire, cycle des éléments nutritifs et de la purification de l’eau à influencer la distribution des micro-organismes et de leur biodiversité dans l’écosystème ¹. lorsque les biofilms sont exposés aux conditions environnementales changeantes ou aux facteurs de stress, tels que les produits chimiques, leur structure de la communauté se déplace rapidement vers plus tolérants à l’espèce^2,3. Leur haute sensibilité transforme biofilms en systèmes modèles attrayants pour surveillance environnementale⁴, toutefois, aucune des méthodes actuelles est parfaitement adapté pour réellement tracer la dynamique d’une communauté de biofilm de manière rapide et facile.

L’ensemble couramment utilisé des méthodes pour caractériser les biofilms consiste à mesurer les paramètres fonctionnels et structurels. Au niveau de l’ensemble de la Communauté, l’activité photosynthétique et respiratoire ainsi que l’activité des enzymes extracellulaires fournit des informations sur l’état fonctionnel du biofilm^{5,6,7,8 ,},⁹. Accumulation de biomasse est utilisée comme un indicateur de la croissance globale de biofilm. Des changements structurels sont actuellement mesurés soit en procédant à l’identification d’espèces traditionnelles avec la microscopie photonique ou axée sur les nucléotides techniques (p. ex., électrophorèse en gel en gradient (DGGE), automatisé ribosomique espaceur intergénique en présence analyse (ARISA), métagénomique)^10,11,12. Ces méthodes fournissent des informations mais prennent du temps pour effectuer ou exiger de connaissances spécifiques ou sont encore en cours d’élaboration. Enfin, les nouvelles méthodes d’évaluation des substances polymériques extracellulaires (EPS)^13,14 et le biofilm architecture¹, tandis que sensible, sont de faible débit et n’ont pas encore été mis au point vers des fins de contrôle.

Il est évident que pour une caractérisation complète des biofilms d’eau douce, il est nécessaire de combiner plusieurs méthodes différentes, qui donnent un aperçu de la fonction de biofilm, la composition et l’architecture. Pour la surveillance de l’environnement, d’autre part, une méthode rapide et sensible qui est capable de détecter des changements dans le biofilm et de permettre une interprétation biologique fondamentale des déplacements au niveau fonctionnel et structurels est nécessaire.

Nous avons développé une nouvelle méthode pour la caractérisation de la communauté microbienne de la composante phototrophe de stream biofilms (périphyton), qui est assez rapide pour des fins de contrôle et en même temps fournit suffisamment d’informations sur la communauté de biofilm structure pour permettre une interprétation biologique¹⁵. Il est basé sur la cytométrie unicellulaires (FC) des échantillons de biofilm et couplé avec visualisation informatique et fournit des informations sur les propriétés optiques et fluorescentes du biofilm au niveau de la cellule unique.

Le flux de travail après l’échantillonnage de biofilm se compose de préparation de l’échantillon sous la forme de la sonication, de fixation et de filtrage par taille des échantillons suivis d’évaluation de l’échantillon par cytométrie en flux. Les données acquises renseignent sur plusieurs traits cellulaires dans une mesure unique : granulométrie, densité, pigment contenu, contenu abiotique (p. ex. microplastiques) dans le biofilm. Cet ensemble de données est qu’analysé via computational visualisation à l’aide de visual voisin stochastique embedding (viSNE)¹⁶, qui permet une interprétation rapide et facile des données. Bien que quelques semaines sont nécessaires pour configurer et optimiser la méthode, une fois mis en place, cela prend seulement quelques heures de collecte des échantillons de biofilm d’interprétation des résultats.

Les principaux avantages de la méthode présentée sur les autres sont la vitesse d’analyse et de la haute teneur en information. En outre, les échantillons peuvent être conservés pendant plusieurs semaines après le prélèvement sans perte de leur optique et propriétés de fluorescence. Cela peut être très utile lorsque la caractérisation d’un grand nombre d’échantillons est nécessaire, comme grand échantillonnages ou programmes de biosurveillance, mais peut aussi fournir une quantité importante d’informations dans les plus petites études exploratoires.

Le protocole présenté repose sur l’analyse de la cytométriques des phototrophes biofilms (périphyton) recueillie à différents sites d’un flux. Beaucoup d’étapes du protocole, par exemple la sélection des sites appropriés pour la pré-écoute, dépendre des objectifs de la recherche et par conséquent ne peut être prescrit. D’autres permettent moins de liberté et nécessitent que le protocole est suivi de près, ceci est rendu clair dans le protocole détaillé ci-dessous.

Le protocole commence par la sélection des sites pour la surveillance environnementale axée sur le biofilm. L’étape suivante consiste à installer le cytomètre en flux (FC) ainsi que ses dimensions permettent la discrimination entre les différents organismes phototrophes vivant dans les biofilms en milieu contrôlé. Cela est effectué par prélèvement d’échantillons de biofilm sur les sites, en identifiant les propriétés fluorescentes de différentes espèces présentes dans le biofilm et de mettre en place le cytomètre de flux avec des lasers et des filtres qui permettent de mesurer à l’optique longueurs d’onde. Une fois que le FC a été mise en place, les biofilms peuvent être recueillies sur les sites périodiquement, les propriétés optiques et fluorescentes des particules présentes dans le biofilm mesurée par cytométrie en flux-et les données analysées par regroupement visuel unique. Pour mieux interpréter les résultats, il est possible de construire une base de données de référence FC d’espèces locales de biofilm-vie et leurs phénotypes et la base de données permet d’identifier les différentes classifications dans les données FC. La validation est possible par le biais de tri basés sur la fluorescence des clusters identifiés des cellules simples utilisant des FACS et axée sur la microscopie des identification taxonomique des espèces présentes. Une représentation schématique du protocole est donnée à la Figure 1.