Karakterisering van aquatische Biofilms met stroom Cytometry

Biofilms zijn dynamische consortia van micro-organismen die een sleutelrol in zoetwater ecosystemen spelen, variërend van primaire productie, nutriënten fietsen en waterzuivering tot het beïnvloeden van de distributie van micro-organismen en hun biodiversiteit in het ecosysteem ¹. Wanneer biofilms worden blootgesteld aan het veranderlijke omgevingsomstandigheden of stressoren, zoals chemische stoffen, de structuur van hun gemeenschap snel verschuift richting meer tolerante soorten^2,3. Hun hoge gevoeligheid verandert biofilms in aantrekkelijke modelsystemen voor milieu bewaking⁴, maar geen van de huidige methoden perfect afgestemd is op de dynamiek van een biofilm Gemeenschap daadwerkelijk te traceren in een snelle en gemakkelijke manier.

De gebruikte set van methoden voor het karakteriseren van biofilms bestaat uit de meting van de functionele en structurele eindpunten. Op het niveau van de gehele Gemeenschap bevat fotosynthetische en respiratoire activiteit alsook de activiteit van extracellulaire enzymen informatie over de functionele toestand van de biofilm^{5,6,7,8 ,9}. De toename van de biomassa wordt gebruikt als een indicator voor de totale groei van de biofilm. Structurele veranderingen zijn momenteel gemeten met behulp van traditionele soorten identificatie met de lichte microscopie van of nucleotide gebaseerde technieken (bijvoorbeeldkleurovergang gelelektroforese (DGGE), geautomatiseerde ribosomal intergenic spacer denaturering analyse (ARISA), metagenomics)^10,11,12. Deze methoden informatie verstrekken maar zijn tijdrovend worden uitgevoerd of wordt vereist specifieke kennis, of zijn nog in ontwikkeling. Tot slot, nieuwe methoden voor de evaluatie van de extracellulaire polymere stoffen (EPS)^13,14 en de biofilm het platform¹, terwijl gevoelig, zijn laag-doorvoer en hebben nog geen ontwikkeld naar redenen van toezicht afgeeft.

Het is duidelijk dat voor een volledige karakterisering van zoetwater biofilms, het noodzakelijk is om het combineren van verschillende methoden, die inzicht geven in de biofilm functie, de samenstelling en de architectuur. Voor milieubewaking, aan de andere kant, is een snelle en gevoelige methode welk vermag opsporing van wijzigingen in de biofilm en inschakelen van elementaire biologische interpretatie van de verschuivingen op de functionele en structurele niveau vereist.

We hebben een nieuwe methode voor de karakterisering van de microbiële Gemeenschap van de fototrofe component van stream biofilms (periphyton), die is snel genoeg voor controledoeleinden, en tegelijkertijd voldoende informatie verstrekt over de biofilm Gemeenschap ontwikkeld structuur om biologische interpretatie¹⁵. Het is gebaseerd op eencellige stroom cytometry (FC) van biofilm monsters en computationele visualisatie wordt gekoppeld en geeft informatie over optische en fluorescerende eigenschappen van de biofilm op het niveau van één cel.

De werkstroom na de biofilm bemonstering bestaat voor de bereiding van de monsters in de vorm van ultrasoonapparaat en fixatie van de monsters, gevolgd door de beoordeling van het monster door de stroom cytometry grootte-gebaseerd filteren. De opgehaalde gegevens bevatten informatie over de verschillende cellulaire eigenschappen in een enkele meting: deeltjesgrootte, dichtheid, pigment content, abiotische inhoud (bijvoorbeeld microplastics) in de biofilm. Deze set van gegevens is dan geanalyseerd via computationele visualisatie met behulp van visuele stochastische buurman insluiten (viSNE)¹⁶, waarmee snel en gemakkelijk interpretatie van de gegevens. Hoewel een paar weken moeten instellen en optimaliseren van de methode, eenmaal ingesteld, duurt het slechts een paar uur van het verzamelen van de biofilm monsters voor de interpretatie van de resultaten.

De belangrijkste voordelen van de onderhavige methode over anderen zijn de snelheid van analyse en hoge-informatie-inhoud. Bovendien kunnen de monsters voor enkele weken na het verzamelen zonder verlies van hun optische en fluorescentie-eigenschappen worden opgeslagen. Dit kan zeer nuttig zijn wanneer de karakterisering van een groot aantal monsters is vereist, zoals grote bemonstering studies of biomonitoring programma’s, maar kan ook voorzien in een aanzienlijke hoeveelheid informatie in kleinere verkennende studies.

De gepresenteerde protocol is gebaseerd op analyse van de stroom-cytometrische van fototrofe biofilms (periphyton) verzameld vanaf verschillende locaties van een stream. Vele stappen van het protocol, bijvoorbeeld de selectie van de programmagebieden geschikt voor controledoeleinden, afhankelijk van de doelstellingen van het onderzoek en daarom niet kunnen worden voorgeschreven. Anderen toestaan minder vrijheid en vereisen dat het protocol is gevolgd, dit wordt duidelijk gemaakt in het hieronder gedetailleerd protocol.

Het protocol begint met de selectie van de programmagebieden voor milieubewaking biofilm gebaseerde. De volgende stap is aan opstelling de stroom-cytometer (FC), zodat de afmetingen inschakelen discriminatie tussen verschillende fototrofe organismen leven in biofilms in de gecontroleerde omgeving. Dit wordt uitgevoerd door het verzamelen van monsters van de biofilm van de sites, identificeren de fluorescerende eigenschappen van verschillende soorten waarvan de aanwezigheid in de biofilm en het opzetten van de stroom-cytometer met lasers en filters waarmee de meting bij de passende optische golflengten. Zodra de FC is set-up, biofilms kunnen worden verzameld van de sites van tijd tot tijd de optische en fluorescerende eigenschappen van de afzonderlijke deeltjes aanwezig zijn in de biofilm gemeten door stroom cytometry en de gegevens geanalyseerd door visuele clustering. Voor betere interpretatie van de resultaten is het mogelijk om te bouwen van een referentiedatabank FC lokale biofilm-levende soorten en hun fenotypes en gebruiken van de database om te identificeren van verschillende taxonomieën in de FC-gegevens. Validatie is het mogelijk door middel van fluorescentie gebaseerde sortering van de geïdentificeerde clusters van afzonderlijke cellen met behulp van FACS en microscopie gebaseerde taxonomische identificatie van de aanwezige soort. Een schematische voorstelling van het protocol wordt gegeven in Figuur 1.