流式细胞仪对水生生物膜的表征
Summary
流式细胞术与视觉聚类结合, 为研究水生生物膜提供了一种简便、快速的方法。它可用于生物膜的表征, 检测生物膜群落结构的变化, 以及检测埋在生物膜中的非生物微粒。
Abstract
生物膜是微生物的动态联合体, 在淡水生态系统中起着关键作用。通过改变其群落结构, 生物膜对环境变化反应迅速, 因而可以用作水质指标。目前, 生物膜评估主要基于综合和功能端点, 如光合或呼吸活动, 不提供关于生物膜群落结构的信息。流式细胞术和计算可视化提供了一种替代性的、敏感的和易于使用的方法来评估群落组成, 特别是淡水生物膜的 photoautotrophic 部分。它只需要基本的样品准备, 然后整个样品通过流式细胞仪运行。单细胞光学和荧光信息用于计算可视化和生物解释。它的主要优势比其他方法是速度的分析和高信息内容的性质。流式细胞仪在单个测量中提供了几种细胞和生物膜特性的信息: 颗粒大小、密度、颜料含量、生物膜中的非生物含量以及粗分类学信息。但是, 它没有提供关于物种水平上的生物膜组成的信息。我们认为, 使用水生生态系统环境监测方法的潜力很大, 作为初步的生物膜评估步骤, 通过补充和更详细的方法向下游进行详细调查。
Introduction
生物膜是微生物的动态联合体, 在淡水生态系统中发挥关键作用, 从初级生产、养分循环和净水到影响微生物在生态系统中的分布及其生物多样性。1. 当生物膜暴露在变化的环境条件或压力源 (如化学物质) 中时, 它们的社区结构迅速转向更容忍的物种2,3。它们的高灵敏度使生物膜成为环境监测的有吸引力的模型系统4, 但是目前的方法都不完全适合于以快速和简便的方式实际跟踪生物膜群落的动态。
通常使用的一套方法来表征生物膜, 包括测量功能和结构端点。在整个社区的水平上, 光合和呼吸活动以及胞外酶活性提供有关生物膜的功能状态的信息5,6,7,8 ,9。生物量应计被用作整体生物膜生长的指标。目前的结构变化是通过使用光学显微镜或基于核苷酸技术的传统物种鉴定 (例如、变性梯度凝胶电泳 (DGGE)、自动核糖体基因间间隔) 来测量的。分析 (ARISA), metagenomics)10,11,12。这些方法提供了信息, 但对于执行或需要特定的知识或仍在开发中是非常耗时的。最后, 评估胞外高分子物质 (EPS)13、14和生物膜结构1的新方法虽然敏感, 但吞吐量低, 尚未发展到监视目的。
很明显, 对于淡水生物膜的完整描述, 有必要结合几种不同的方法, 这就提供了对生物膜功能, 组成和结构的洞察。另一方面, 为了进行环境监测, 需要一种快速而灵敏的方法, 能够检测生物膜的变化, 并对功能和结构层面上的转变进行基本的生物解释。
我们开发了一种新的方法, 微生物群落的 phototrophic 成分的流生物膜 (periphyton), 这是足够快的监测目的, 并同时提供充分的信息, 生物膜群落允许生物解释15的结构。它是基于单细胞流式细胞术 (FC) 的生物膜样品, 并结合计算可视化, 并提供信息的光和荧光性质的生物膜在单细胞水平。
生物膜取样后的工作流包括样品的制备, 以超声波、固定和大小为基础的过滤, 然后通过流式细胞仪对样品进行评估。所获得的数据提供了一个单一的测量中的几个细胞特性的信息: 颗粒大小, 密度, 颜料含量, 非生物含量 (例如microplastics) 在生物膜。这组数据比通过可视化随机邻域嵌入 (viSNE)16的计算可视化进行分析, 从而能够快速、方便地解释数据。虽然需要几个星期的时间来建立和优化方法, 一旦建立, 它只需要几个小时收集生物膜样本, 以解释结果。
所提出方法的主要优点是分析速度快, 信息内容高。此外, 样品可在收集后数周储存, 而不会丧失其光学和荧光特性。当需要对大量样本进行描述时, 例如大型取样研究或生物监测技术程序, 但也可以在较小的探索性研究中提供大量信息, 这一点非常有用。
提出的协议是基于流细胞分析的 phototrophic 生物膜 (periphyton) 收集从不同地点的溪流。协议的许多步骤,例如选择适合于监视目的的站点, 取决于研究的目标, 因此不能规定。另一些人则允许较少的自由, 并要求严格遵守该议定书, 下面的详细议定书将对此作出明确说明。
该议定书的出发点是选择以生物膜为基础的环境监测地点。下一步是建立流式细胞仪 (FC), 使其测量能够使在受监测环境中生活在生物膜中的不同 phototrophic 生物体之间存在歧视。这是通过收集来自这些地点的生物膜样本, 确定在生物膜中的不同物种的荧光特性, 并设置流式细胞仪与激光和过滤器, 使测量在适当的光学波长。一旦建立了 FC, 可以周期性地收集生物膜, 用流式细胞仪测量生物膜中的单个粒子的光学和荧光特性, 以及通过视觉聚类分析的数据。为了更好地解释结果, 有可能建立一个 fc 参考数据库的地方生物膜生物物种及其表型, 并利用数据库, 以确定不同分类法的 fc 数据。验证是可能的, 通过荧光分类的鉴定的单一细胞簇使用的外地观察团和显微镜下的分类鉴定目前的物种。协议的示意图在图 1中给出。
Protocol
Representative Results
Discussion
上面描述的协议相对简单, 可以实现。然而, 虽然所提出的默认设置已被证明适用于迄今为止所测试的所有 phototrophic 生物膜, 但优化 (如协议中所描述的) 对于最大化从该方法获得的信息是必要的。事实上, 根据环境条件 (季节、温度、水的化学成分)1, 生物膜的光学和荧光特性会有所不同。因此, 在设置 FC 分析时, 必须考虑到这种可变性。这样做的一个方法是, 从取样点采集生物膜?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
所提出的工作得到了 SNF Ambizione 奖学金 (PZ00P2_142533) 和 Velux 研究补助金 (Amplebig) 的支持。我们要感谢贝蒂娜瓦格纳对实验工作的帮助。
Materials
| Multimeter | WTW | MultiLine 3620 IDS | For measuring temperature, pH, dissolved oxygen |
| Ultrasonic cleaner | VWR International | 97043-986 | Tank dimesions: 15*14*10 cm |
| Flow cytometer | Beckman Coulter | Gallios | Lasers: 405, 488 and 638 nm. Filters bands in Supplementary Table 11. Sgier et, Nat Comm, 2016. |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 | used for selecting appropriate setting of the FC |
| Cell sorter | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | Settings in Supplementary Table 12. Sgier et, Nat Comm, 2016. |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert 135 | Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0.75 objective |
| SOFTWARE | |||
| Matlab | MathWorks | R2013a | software for numerical computing |
| CYT | Dana Pe'er Lab | Version 1.1 | free interactive visualization tool for analysis of cytometry data |
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