توصيف الأغشية الحيوية المائية مع التدفق الخلوي
Summary
التدفق الخلوي في تركيبة مع المجموعات المرئية يوفر وسيلة سهلة الاستخدام وسريعة لدراسة الأغشية الحيوية المائية. يمكن استخدامه لتوصيف بيوفيلم، الكشف عن التغيرات في هيكل المجتمع بيوفيلم، والكشف عن الجسيمات اللاأحيائية جزءا لا يتجزأ من بيوفيلم.
Abstract
الأغشية الحيوية هي اتحادات الحيوي من الكائنات الدقيقة التي تلعب دوراً أساسيا في النظم الإيكولوجية للمياه العذبة. عن طريق تغيير بنية المجتمع بهم، الاستجابة بسرعة للتغيرات البيئية الأغشية الحيوية ويمكن استخدامها كمؤشرات لنوعية المياه وهكذا. في الوقت الراهن، يستند تقييم بيوفيلم معظمهم نهايات التكاملي والوظيفي، مثل نشاط التمثيل الضوئي أو الجهاز التنفسي، التي لا تقدم معلومات عن هيكل المجتمع بيوفيلم. التدفق الخلوي والتصور الحسابية يوفر طريقة بديلة وحساسة، وسهلة الاستخدام لتقييم تكوين المجتمع، لا سيما الجزء فوتواوتوتروفيك من المياه العذبة الأغشية الحيوية. فهو يتطلب إعداد العينة الأساسية فقط، بعدها يتم تشغيل نموذج كامل عن طريق سيتوميتير تدفق. يتم استخدام المعلومات البصرية ونيون خلية واحدة للتصور الحسابية والتفسير البيولوجي. مميزاتها الرئيسية عبر طرق أخرى هي سرعة التحليل وطبيعة عالية-معلومات-المحتوى. التدفق الخلوي ويقدم معلومات عن العديد من الصفات الخلوية وبيوفيلم في قياس واحد: حجم الجسيمات، والكثافة، محتوى الصباغ، محتوى اللاأحيائية في بيوفيلم، والمعلومات التصنيفية الخشنة. بيد أنه لا يقدم معلومات عن تكوين بيوفيلم على مستوى الأنواع. ونحن نرى إمكانية كبيرة في استخدام طريقة للرصد البيئي للنظم الإيكولوجية المائية كتقييم أولى بيوفيلم مفصلة الخطوة التي يبلغ مجرى النهر التحقيقات بأساليب متكاملة وأكثر تفصيلاً.
Introduction
الأغشية الحيوية هي اتحادات الحيوي من الكائنات الدقيقة التي تلعب دوراً أساسيا في النظم الإيكولوجية للمياه العذبة، بدءاً من الإنتاج الأولى، والمغذيات، وتنقية المياه إلى التأثير على توزيع الكائنات الحية الدقيقة وتنوعها البيولوجي في النظام الإيكولوجي 1-عندما يتعرض الأغشية الحيوية للظروف البيئية المتغيرة أو لعوامل الإجهاد، مثل المواد الكيميائية، على بنية المجتمع بسرعة التحولات نحو أكثر تسامحا الأنواع2،3. يتحول حساسية عالية الأغشية الحيوية إلى نموذج جذاب نظم ل الرصد البيئي4، إلا أن أيا من الأساليب الحالية تعتبر مناسبة تماما لتتبع دينامية مجتمع بيوفيلم فعلا بطريقة سريعة وسهلة.
مجموعة شائعة من أساليب لتوصيف الأغشية الحيوية يتكون القياس من نقاط النهاية الوظيفية والهيكلية. على مستوى المجتمع بأكمله، نشاط التمثيل الضوئي والجهاز التنفسي، فضلا عن نشاط إنزيمات خارج الخلية ويقدم معلومات عن الدولة الوظيفية بيوفيلم5،،من67،8 ،9. الاستحقاق الكتلة الحيوية كمؤشر للنمو بيوفيلم العام. يتم قياس التغيرات الهيكلية حاليا أما باستخدام تعريف الأنواع التقليدية الخفيفة الميكروسكوب أو مع التقنيات المستندة إلى النوكليوتيدات (مثلاً، يشوه جل التدرج التفريد (دج)، فاصل إينتيرجينيك ريبوسومال الآلي تحليل (اريسا)، metagenomics)10،،من1112. هذه الأساليب توفير المعلومات ولكن تستغرق وقتاً طويلاً لإجراء، أو يتطلب معرفة محددة، أو لا تزال قيد التطوير. وأخيراً، أساليب جديدة للتقييم لل13،المواد البوليمرية خارج الخلية (EPS)14 وبيوفيلم العمارة1، بينما يراعي، الإنتاجية منخفضة ولم توضع حتى الآن نحو أغراض الرصد.
فمن الواضح أن لتوصيف كامل للأغشية الحيوية المياه العذبة، من الضروري الجمع بين عدة طرق مختلفة، التي توفر نظرة ثاقبة وظيفة بيوفيلم وتكوينها والهندسة المعمارية. للرصد البيئي، من ناحية أخرى، طريقة سريعة والحساسة التي قادرة على الكشف عن التغييرات في بيوفيلم وتمكين تفسير البيولوجية الأساسية من التحولات على المستوى الوظيفي والهيكلي المطلوب.
لقد قمنا بتطوير أسلوب جديد لتوصيف المجتمع الميكروبي لعنصر فوتوتروفيك تيار الأغشية الحيوية (periphyton)، وهي سريعة بما يكفي لأغراض الرصد، وفي نفس الوقت يقدم معلومات كافية عن المجتمع بيوفيلم هيكل للسماح للتفسير البيولوجي15. أنه استناداً إلى خلية واحدة التدفق الخلوي (FC) من عينات بيوفيلم ويقترن التصور الحسابية ويوفر معلومات عن الخصائص البصرية ونيون بيوفيلم على مستوى الخلية الواحدة.
يتكون سير العمل بعد أخذ العينات بيوفيلم لإعداد نموذج في شكل sonication والتثبيت وعلى أساس حجم تصفية عينات متبوعاً بتقييم العينة بالتدفق الخلوي. البيانات المكتسبة بتقديم معلومات عن العديد من الصفات الخلوية في قياس واحد: حجم الجسيمات، والكثافة، محتوى الصباغ، اللاأحيائية المحتوى (مثل ميكروبلاستيكس) في بيوفيلم. هذه المجموعة من البيانات من تحليلها عن طريق التصور الحسابية الجار العشوائية المرئية التضمين (فيسني)16، الذي يتيح لتفسير البيانات بسرعة وسهولة باستخدام. على الرغم من أن بضعة أسابيع هي المطلوبة لإعداد وتحسين الأسلوب، مرة بإعداد، فإنه يأخذ فقط بضع ساعات من جمع عينات بيوفيلم لتفسير النتائج.
المزايا الرئيسية لأسلوب عرضها على الآخرين هي سرعة التحليل وعالية-معلومات-المحتوى. وعلاوة على ذلك، يمكن تخزين العينات لعدة أسابيع بعد جمع دون فقدان بهم الضوئية وخصائص الأسفار. يمكن أن يكون هذا مفيداً عندما وصف عدد كبير من العينات المطلوبة، مثل دراسات عينات كبيرة أو برامج الرصد البيولوجي، ولكن يمكن أيضا أن توفر كمية كبيرة من المعلومات في أصغر من الدراسات الاستكشافية.
البروتوكول قدم يستند إلى تحليل تدفق سيتوميتريك فوتوتروفيك الأغشية الحيوية (periphyton) التي تم جمعها من مواقع مختلفة من دفق. العديد من الخطوات للبروتوكول، مثل اختيار مواقع مناسبة لأغراض، الرصد تعتمد على أهداف البحث و ولذلك لا يمكن وصفه. الآخرين السماح أقل حرية، وتتطلب أن البروتوكول هو تابع عن كثب، وهذا هو توضيحها في البروتوكول بالتفصيل أدناه.
البروتوكول يبدأ باختيار مواقع للرصد البيئي على أساس بيوفيلم. والخطوة التالية لإنشاء التدفق–سيتوميتير (FC) حيث أن تمكين قياساته التمييز بين الكائنات فوتوتروفيك مختلفة تعيش في الأغشية الحيوية في رصد البيئة. هذا يتم عن طريق جمع عينات بيوفيلم من المواقع، وتحديد خصائص الأنواع المختلفة الموجودة في بيوفيلم وإعداد التدفق–سيتوميتير مع أشعة الليزر وعوامل التصفية التي تمكن من قياس في المناسبة الضوئية الفلورية الأطوال الموجية. وبمجرد لجنة التيسير وقد تم إنشاء، الأغشية الحيوية يمكن جمعها من المواقع دورياً، خصائص الجسيمات مفردة موجودة في بيوفيلم تقاس بالتدفق الخلوي، وبيانات تحليلها من قبل المجموعات المرئية البصرية ونيون. أفضل تفسير للنتائج، فمن الممكن بناء قاعدة مرجعية FC الأنواع الحية بيوفيلم المحلية وتعمل بها، واستخدام قاعدة البيانات للتعرف على التصنيفات المختلفة في البيانات FC. من الممكن التحقق من الصحة من خلال الأسفار-على أساس فرز المجموعات المحددة للخلايا المفردة باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية وتحديد التقسيمي القائم على الفحص المجهري للأنواع الحالية. ويرد في الشكل 1تخطيطي للبروتوكول.
Protocol
Representative Results
Discussion
بسيطة نسبيا لتنفيذ البروتوكول، المذكورة أعلاه. ومع ذلك، بينما أظهرت الإعدادات الافتراضية المعروضة تكون مناسبة لجميع فوتوتروفيك بيوفيلم اختبارها حتى الآن، الأمثل (كما هو موضح في البروتوكول) اللازمة لتحقيق أقصى قدر من المعلومات المستقاة من الأسلوب. وفي الواقع، يمكن أن تختلف الخصائص البصر…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أيد العمل قدمت زمالة أمبيزيوني الجبهة الوطنية الصومالية (PZ00P2_142533) ومنحة بحثية فيلا (أمبليبيج). نود أن نشكر بتينا فاغنر للحصول على تعليمات العمل التجريبي.
Materials
| Multimeter | WTW | MultiLine 3620 IDS | For measuring temperature, pH, dissolved oxygen |
| Ultrasonic cleaner | VWR International | 97043-986 | Tank dimesions: 15*14*10 cm |
| Flow cytometer | Beckman Coulter | Gallios | Lasers: 405, 488 and 638 nm. Filters bands in Supplementary Table 11. Sgier et, Nat Comm, 2016. |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 | used for selecting appropriate setting of the FC |
| Cell sorter | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | Settings in Supplementary Table 12. Sgier et, Nat Comm, 2016. |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert 135 | Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0.75 objective |
| SOFTWARE | |||
| Matlab | MathWorks | R2013a | software for numerical computing |
| CYT | Dana Pe'er Lab | Version 1.1 | free interactive visualization tool for analysis of cytometry data |
References
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Nat Rev Microbiol. 14 (4), 251-263 (2016).
- Rotter, S., Heilmeier, H., Altenburger, R., Schmitt-Jansen, M. Multiple stressors in periphyton – comparison of observed and predicted tolerance responses to high ionic loads and herbicide exposure. J Appl Ecol. 50 (6), 1459-1468 (2013).
- Tlili, A., et al. Pollution-induced community tolerance (PICT): towards an ecologically relevant risk assessment of chemicals in aquatic systems. Freshw Biol. 61 (12), 2141-2151 (2016).
- Lavoie, I., Lavoie, M., Fortin, C. A mine of information: Benthic algal communities as biomonitors of metal contamination from abandoned tailings. Science of the Total Environment. 425, 231-241 (2012).
- Tlili, A., Montuelle, B., Berard, A., Bouchez, A. Impact of chronic and acute pesticide exposures on periphyton communities. Sci Total Environ. 409 (11), 2102-2113 (2011).
- Dorigo, U., et al. Lotic biofilm community structure and pesticide tolerance along a contamination gradient in a vineyard area. Aquat Microb Ecol. 50 (1), 91-102 (2007).
- Pesce, S., et al. Evaluation of single and joint toxic effects of diuron and its main metabolites on natural phototrophic biofilms using a pollution-induced community tolerance (PICT) approach. Aquat Toxicol. 99 (4), 492-499 (2010).
- Ricart, M., et al. Effects of low concentrations of the phenylurea herbicide diuron on biofilm algae and bacteria. Chemosphere. 76 (10), 1392-1401 (2009).
- Martinez, A., Kominoski, J. S., Larranaga, A. Leaf-litter leachate concentration promotes heterotrophy in freshwater biofilms: Understanding consequences of water scarcity. Sci Total Environ. , 1677-1684 (2017).
- Corcoll, N., et al. Comparison of four DNA extraction methods for comprehensive assessment of 16S rRNA bacterial diversity in marine biofilms using high-throughput sequencing. Fems Microbiol Lett. 364 (14), (2017).
- Welsh, A. K., McLean, R. J. Characterization of bacteria in mixed biofilm communities using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Curr Protoc Microbiol. , (2007).
- Ranjard, L., et al. Characterization of bacterial and fungal soil communities by automated ribosomal intergenic spacer analysis fingerprints: Biological and methodological variability. Appl Environm Microbiol. 67 (10), 4479-4487 (2001).
- Stewart, T. J., Traber, J., Kroll, A., Behra, R., Sigg, L. Characterization of extracellular polymeric substances (EPS) from periphyton using liquid chromatography-organic carbon detection-organic nitrogen detection (LC-OCD-OND). Environ Sci Pollut R. 20 (5), 3214-3223 (2013).
- Kroll, A., et al. Mixed messages from benthic microbial communities exposed to nanoparticulate and ionic silver: 3D structure picks up nano-specific effects, while EPS and traditional endpoints indicate a concentration-dependent impact of silver ions. Environ Sci Pollut R. 23 (5), 4218-4234 (2016).
- Sgier, L., Freimann, R., Zupanic, A., Kroll, A. Flow cytometry combined with viSNE for the analysis of microbial biofilms and detection of microplastics. Nat Commun. 7, 11587 (2016).
- Amir el, A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nat Biotechnol. 31 (6), 545-552 (2013).
- Mora-Gomez, J., Freixa, A., Perujo, N., Barral-Fraga, L. Limits of the biofilm concept and types of aquatic biofilms. Aquatic Biofilms: Ecology, Water Quality and Wastewater Treatment. , 3-27 (2016).
- Matthaei, C. D., Guggelberger, C., Huber, H. Local disturbance history affects patchiness of benthic river algae. Freshw Biol. 48 (9), 1514-1526 (2003).
- Tlili, A., Hollender, J., Kienle, C., Behra, R. Micropollutant-induced tolerance of in situ periphyton: Establishing causality in wastewater-impacted streams. Water Res. 111, 185-194 (2017).
- Robinson, C. T., Rushforth, S. R. Effects of physical disturbance and canopy cover on attached diatom community structure in an idaho stream. Hydrobiologia. 154, 49-59 (1987).
- Pomati, F., Nizzetto, L. Assessing triclosan-induced ecological and trans-generational effects in natural phytoplankton communities: A trait-based field method. Ecotoxicology. 22 (5), 779-794 (2013).
- Hulliger, J. . Methoden zur Untersuchung und Beurteilung der Fliessgewässer. , (2007).
- Tlili, A., et al. In situ spatio-temporal changes in pollution-induced community tolerance to zinc in autotrophic and heterotrophic biofilm communities. Ecotoxicology. 20 (8), 1823-1839 (2011).
- Foladori, P., Laura, B., Gianni, A., Giuliano, Z. Effects of sonication on bacteria viability in wastewater treatment plants evaluated by flow cytometry – Fecal indicators, wastewater and activated sludge. Water Res. 41 (1), 235-243 (2007).
- Buesing, N., Gessner, M. O. Comparison of detachment procedures for direct counts of bacteria associated with sediment particles, plant litter and epiphytic biofilms. Aquat Microb Ecol. 27 (1), 29-36 (2002).
- van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing Data using t-SNE. J Mach Learn Res. 9, 2579-2605 (2008).
- van der Maaten, L. Accelerating t-SNE using Tree-Based Algorithms. J Mach Learn Res. 15, 3221-3245 (2014).
