Verimli üretimi, pankreas/oniki parmak bağırsağı Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/pankreas ataları hPSCs yapışma kültürlerde üzerinden
Summary
Burada, pankreas/oniki parmak bağırsağı homeobox protein 1+ insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) ayırt etmek için ayrıntılı bir iletişim kuralı mevcut (PDX1+) hücreleri pankreas soy nesil için alan koloni sigara türü monolayer büyüme üzerinde tek hücre ayrışmış. Bu yöntem homojen hPSC elde edilen hücreleri, genetik manipülasyon üreten ve eleme için uygundur.
Abstract
İnsan pluripotent kök hücre (hPSC)-türetilmiş pankreas hücreleri rejeneratif tıp ve insan gelişim süreçlerini incelemek için bir platform için umut verici bir hücre kaynağı vardır. Stepwise gelişimsel süreçleri beyannamedir farklılaşma pankreas hücreleri pankreas/oniki parmak bağırsağı homeobox protein 1+ de dahil olmak üzere oluşturmak için en önemli yollarından biri yönlendirilir (PDX1+) pankreas progenitör hücre. Geleneksel iletişim kuralları ile küçük koloniler farklılaşma geçişini kısa bir süre sonra Başlat. Ancak, koloniler veya toplamları, hücre farklılaşması için PDX1 engel heterogeneities eğilimli durumdadır+ hücreleri. Burada, hPSCs PDX1 ayırt etmek için ayrıntılı bir iletişim kuralı mevcut+ hücreleri. Protokol dört adımlardan oluşur ve farklılaşma tohumlama Disosiye tek hücreleri tarafından başlatır. SOX17 indüksiyon+ kesin endoderm hücreleri PDX1 iki ilkel gut tüp işaretleri, HNF1β ve HNF4α ve nihai farklılaşma ifade tarafından takip edildi+ hücreleri. Mevcut Protokolü kolay kullanım sağlar ve geliştirmek ve verimsiz endodermal soy veya PDX1 ayırt etmek için daha önce bulunan bazı hPSC satırları farklılaşma verimliliğini stabilize+ hücreleri.
Introduction
Pankreas esas ekzokrin ve endokrin hücreleri oluşur ve onun disfonksiyon ya da aşırı pankreatit, diyabet ve pankreas kanseri gibi birçok hastalıklara neden olur. Pancreatopathy pathogeny aydınlatmak için pankreas hücrelerinin işlevini ve gelişim sürecinin analiz etmek gereklidir. Buna ek olarak, istikrarlı hücre kaynağı sağlam kalite ile hücre/doku takviyesi terapi kurmak için gereklidir. İnsan pluripotent kök hücre (hPSC)-türetilmiş pankreas hücreleri bu amaçlar için umut verici bir hücre kaynak vardır ve farklılaşma Protokolü pankreas hücreleri doğru çalışılmış1,2,3, oldu 4. Pankreas β hücrelerinin tüp üretimi son gelişmeler yetişkin insan ve bu hücreleri Haritayı terapötik etkinlik implantasyon diyabetik modeli fareler2,3içine üzerine β hücrelerinin üretimi taklit. Buna ek olarak, çözümleme İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs) sağlıklı ve tip 1 diyabet hasta bağış üretilen β hücrelerinin stres5ne zaman altında dahil olmak üzere hiçbir işlevsel farklılıklar ortaya. Ayrıca, hastalık fenotipleri kısmen hasta elde iPSCs veya hasta6,7aynı sitedeki Genetik mutasyonlar yataklık hPSCs ile indüklenen pankreas hücrelerinde yeniden.
HPSCs pankreas hücreleri üretmek için gelişimsel süreçleri beyannamedir kademeli yönlendirilmiş farklılaşma kullanılır. Pankreas bölgesi Y-box 17 (SOX17) belirleme seks ifade erken embriyonun endoderm katmandan türetilir ve forkhead kutusu A2 (FOXA2)8. Tabanlı üzerinde fare çalışmaları, Hepatosit nükleer faktör 1-beta (Hnf1β) ve Hepatosit nükleer faktör 4-alfa (Hnf4α) ifade tarafından işaretlenir ilkel gut tüp endodermal katman oluşturur. İlkel gut tüp hisli ve solunum aygıtı, sindirim sistemi ve organları gelişir. Uzama sonra meşru pankreas bölge posterior foregut bölge oluyor 1 (PDX1)8,9,10transkripsiyon faktörü pankreas/oniki parmak bağırsağı homeobox protein ifade tarafından işaretlenmiş gibi. PDX1 dorsal ve ventral bölümlerini+ gut tüp kalınlaşmasına 1 (NKX6.1)8,11pankreas transkripsiyon faktörü 1 alt birim alfa (PTF1A) ve NK6 homeobox ortak ifade tarafından işaretlenen formu pankreas tomurcukları için. Bu ifade pankreas organogenesis morfolojik başlangıcı işaretler. Bileşenleri pankreas tomurcukları olan pankreas endoderm hücreleri epitelyal yapıları12 dallı bir borulu ağı ve sonunda insülin salgılayan β-hücreleri de dahil olmak üzere ekzokrin ve endokrin hücrelere ayırt etmek ve glukagon salgılayan α-hücreleri. PDX1 ifade ilk, o zaman tüm pankreas geliştirme görülmektedir ve yerelleştirme β ve δ hücreleri9,13,14gösterir meşru pankreas bölge tespit edilmiştir. Her ne kadar Pdx1+ Ptf1a veya Nkx6.1 ifade değil hücre alan ayırır Gastrik test, oniki parmak bağırsağı, extrahepatic safra kanalını ve bazı bağırsak hücreleri geç aşamada fareler9, PDX1 geliştirme ortasında içine+ hücrelerin CSF’den pankreas insanlarda erken gelişimsel aşamada kabul edilir.
Burada, hPSCs PDX1 ayırt etmek için ayrıntılı bir iletişim kuralı mevcut+ hücreleri pankreas soy nesil için. Tohum tarafından Protokolü başlatır farklılaşma tek hücreler15,16,17ayrışmış. Genel olarak, farklılaşmamış hPSCs koloniler veya hücre toplamları süspansiyon veya yapışma olarak korunur. Sonuç olarak, kısa bir süre sonra passaging farklılaşma çoğu protokolleri başlatın. Koloniler veya toplamları durumda, hücre hangi engel kayma ve transkripsiyon heterogeneities18,19,20,21,22‘ ye, ancak, yatkındır kesin endoderm doğru ilk farklılaşma adım takip verimsiz farklılaşma tarafından PDX1 için+ hücreleri. Mevcut Protokolü geliştirmek ve farklılaşma verimlilik için kolay kullanım sunabilir verimsiz endodermal soy ve PDX1 ayırt etmek için daha önce bulunan bazı hPSC satırları23, + hücreleri 24 , 25.
Protocol
Representative Results
Discussion
PDX1 üretimi+ hücreleri oluşur birden çok adımı; Bu nedenle, uygun bir zamanda hücreleri tedavi için önemlidir. Adımları arasında kesin endoderm indüksiyon verimliliğini büyük ölçüde son indüksiyon verimliliği etkiler, muhtemelen çoğalırlar salgılar ve/veya diğer bulaşıcı lineage (yani, mesoderm ve hücrelerindeki ektoderm), girişim tarafından faktörler belirli farklılaşma bozabilir. Eğer SOX17 oranı+ hücreleri %80 düşük günde 4 (sahne 1B), PDX1 için verimli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser kısmen Japonya toplumdan için promosyon, bilim (JSP’ler) Scientific Research (C) (JSP’ler KAKENHI Grant Number15K09385 ve 18 K 08510) aracılığıyla T.T. ve Grant-in-Aid JSP’ler araştırma Fellows (JSP’ler KAKENHI Grant numarası için finansman tarafından desteklenen 17J07622) A.K. ve tıbbi araştırma ve geliştirme (AMED) kendi araştırma yoluyla Japonya ajansı “IP’leri hücre araştırma, Araştırma Merkezi ağ rejeneratif tıp gerçekleşmesi için çekirdek Merkezi” K.O. için vermek Yazarlar Dr Peter Karagiannis yazı okumak için teşekkür ederiz.
Materials
| 3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine | Toronto Research Chemicals | K171000 | CYC |
| 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid | Santa Cruz Biotechnology | SC-203303 | TTNPB |
| 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y] | Abcam | Ab76541 | Anti-CDX2, × 1/1000 dilution |
| B-27 Supplement (50 ×) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | Serum-free supplement |
| BD FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | For flow cytometry | |
| Biomedical freezer | SANYO | MDF-U538 | For -30 °C storing |
| Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-Chamber | BIO-RAD | 1450011 | Counting slide glass |
| CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEAR | Greiner bio-one | 657165 | For differentiation culture/6-well plate |
| Centrifuge | TOMY | AX-310 | For cell culturing |
| Centrifuge | TOMY | MX-305 | For RT-qPCR |
| CHIR99021 | Axon Medchem | Axon 1386 | |
| CLEAN BENCH | SHOWA KAGAKU | S-1601PRV | Clean bench |
| Corning CellBIND 6-well plate | Corning | 3335 | For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| Corning Synthemax II-SC Substrate | Corning | 3535 | For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs |
| Cryostat | Leica | Leica CM1510 S | For immunostaining of aggregates. |
| Cytofix/Cytoperm Kit | Becton Dickinson | 554714 | Perm/Wash buffer is Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer. |
| Dako pen | Dako | S2002 | For immunostaining of aggregates |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18427-088 | For RT-qPCR |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10040 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey Serum | Merck Millipore | S30 | Donkey serum |
| D-PBS(-) without Ca or Mg | Nacalai tesque | 14249-95 | DPBS |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium |
| Falcon 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 5 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer |
| Filter Tip, 1000 µL | Watoson | 124-1000S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 20 µL | Watoson | 124-P20S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 200 µL | Watoson | 124-P200S | Use together with pipettes |
| Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X700 | For immunostaining |
| Forma Steri-Cycle CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370A | Incubator |
| HNF-1β Antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7411 | Anti-HNF1β, × 1/200 dilution |
| HNF-4α Antibody (H-171) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8987 | Anti-HNF4α, × 1/200 dilution |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | For nucleus staining, × 1/200 dilution |
| Human Pancreas Total RNA | Ambion | AM7954 | For RT-qPCR |
| Human PDX-1/IPF1 Antibody | R&D Systems | AF2419 | Anti-PDX1, goat IgG, × 1/200 dilution |
| Human SOX17 Antibody | R&D Systems | AF1924 | Anti-SOX17, × 1/200 dilution |
| Improved MEM Zinc Option medium | Thermo Fisher Scientific | 10373-017 | iMEM |
| Incubation chamber | Cosmo Bio | 10DO | For immunostaining of aggregates |
| Latex Examination Gloves | Adachi | ||
| MAS coated slide glass | Matsunami Glass | 83-1881 | For immunostaining of aggregates |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | 4346907 | For RT-qPCR |
| Microscope | Olympus | CKX41N-31PHP | For cell culturing |
| Microtube | Watoson | 131-515CS | |
| Monoclonal Anti-α-Fetoprotein | SIGMA | A8452 | Anti-AFP, × 1/200 dilution |
| Nanodeop 8000 | Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Oligo dT | FASMAC | Custom made Oligo | For RT-qPCR of sequence is "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT" |
| Paraformaldehyde, powder | Nacalai tesque | 26126-54 | PFA, fixative, diluted in DPBS |
| Pharmaceutical refrigerator | SANYO | MPR-514 | For 4 °C storing |
| PIPETMAN P | GILSON | Pipette | |
| Recombinant Human KGF/FGF-7 | R&D Systems | 251-KG | KGF |
| Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | NOGGIN |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A | R&D Systems | 338-AC | Activin A |
| ReverTra Ace (100 U/μL) | TOYOBO | TRT-101 | For RT-qPCR |
| Rnase-Free Dnase Set (50) | QIAGEN | 79254 | For RT-qPCR |
| Rneasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | For RT-qPCR |
| RPMI 1640 with L-Gln | Nacalai tesque | 30264-85 | RPMI 1640 |
| Sealing Film for Real Time | Takara | NJ500 | For RT-qPCR |
| Serological pipettes 10 mL | Costar/Corning | 4488 | For cell culturing |
| Serological pipettes 25 mL | Costar/Corning | 4489 | For cell culturing |
| Serological pipettes 5 mL | Costar/Corning | 4487 | For cell culturing |
| Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb | Cell signaling | 3579S | Anti-SOX2, × 1/200 dilution |
| StepOnePlus | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Sucrose | Nacalai tesque | 30406-25 | For immunostaining of aggregates |
| TB Green Premix Ex Taq II |
Takara | RR820B | For RT-qPCR |
| TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450101J1 | Automatic cell counter |
| Tissue-Tek OCT compound 4583 | Sakura Finetechnical | 4583 | For immunostaining of aggregates |
| Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters | Sakura Finetechnical | 4566 | For immunostaining of aggregates |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Trypan Blue | BIO-RAD | 1450021 | |
| Ultracold freezer | SANYO | MDF-U33V | For -80 °C storing |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | Dilute with DPBS to prepare 0.5 mM EDTA |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Y-27632 | Wako | 251-00514 |
References
- D’Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Kondo, Y., Toyoda, T., Inagaki, N., Osafune, K. iPSC technology-based regenerative therapy for diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 9 (2), 234-243 (2017).
- Millman, J. R., et al. Generation of stem cell-derived beta-cells from patients with type 1 diabetes. Nature Communications. 7, 11463 (2016).
- Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
- Hosokawa, Y., et al. Insulin-producing cells derived from ‘induced pluripotent stem cells’ of patients with fulminant type 1 diabetes: Vulnerability to cytokine insults and increased expression of apoptosis-related genes. Journal of Diabetes Investigation. , (2017).
- Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
- Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
- Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
- Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
- Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
- Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochemical Journal. 310 (Pt 3), 997-1003 (1995).
- Riedel, M. J., et al. Immunohistochemical characterisation of cells co-producing insulin and glucagon in the developing human pancreas. Diabetologia. 55 (2), 372-381 (2012).
- Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367 (2013).
- Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
- Toyoda, T., et al. Rho-Associated Kinases and Non-muscle Myosin IIs Inhibit the Differentiation of Human iPSCs to Pancreatic Endoderm. Stem Cell Reports. 9 (2), 419-428 (2017).
- Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Nguyen, Q. H., et al. Single-cell RNA-seq of human induced pluripotent stem cells reveals cellular heterogeneity and cell state transitions between subpopulations. Genome Research. 28 (7), 1053-1066 (2018).
- Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 121 (3), 1217-1221 (2011).
- Rosowski, K. A., Mertz, A. F., Norcross, S., Dufresne, E. R., Horsley, V. Edges of human embryonic stem cell colonies display distinct mechanical properties and differentiation potential. Scientific Reports. 5, 14218 (2015).
- Torres-Padilla, M. E., Chambers, I. Transcription factor heterogeneity in pluripotent stem cells: a stochastic advantage. Development. 141 (11), 2173-2181 (2014).
- Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 14 (6), 357-368 (2013).
- Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
- Kimura, A., et al. Small molecule AT7867 proliferates PDX1-expressing pancreatic progenitor cells derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 24, 61-68 (2017).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).
- Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), (2015).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 109 (31), 12538-12543 (2012).
- Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson’s disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
- Suemori, H., et al. Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long-term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage. Biochemical and Biophysical Research Communication. 345 (3), 926-932 (2006).
- Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), e82076 (2013).
- Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
- Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
- Kelly, O. G., et al. Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 29 (8), 750-756 (2011).
- Hohwieler, M., et al. Human pluripotent stem cell-derived acinar/ductal organoids generate human pancreas upon orthotopic transplantation and allow disease modelling. Gut. 66 (3), 473-486 (2017).
- Takeuchi, H., Nakatsuji, N., Suemori, H. Endodermal differentiation of human pluripotent stem cells to insulin-producing cells in 3D culture. Scientific Reports. 4, 4488 (2014).
