Eficiente generación de páncreas/duodeno Homeobox proteína 1+ progenitores del Foregut pancreática Posterior de hPSCs en las culturas de la adherencia
Summary
Aquí, presentamos un protocolo detallado para distinguir las células de vástago pluripotent humanas (hPSCs) en la proteína de páncreas/duodeno homeobox 1+ (PDX1+) las células para la generación de linajes pancreáticos basan en el crecimiento de monocapa tipo de Colonia no de disociar las células. Este método es adecuado para producir células derivadas del hPSC homogéneas, manipulación genética y selección.
Abstract
Célula de vástago de pluripotent humanas (hPSC)-derivado de las células pancreáticas son una fuente prometedora de células para la medicina regenerativa y una plataforma para el estudio de procesos de desarrollo humanos. Paso a paso dirigido a la diferenciación que recapitula los procesos de desarrollo es una de las principales formas de generar células pancreáticas incluyendo proteína de páncreas/duodeno homeobox 1+ (PDX1+) células progenitoras pancreáticas. Protocolos convencionales inician la diferenciación con pequeñas colonias poco después del paso. Sin embargo, en el estado de colonias o agregados de células son propensas a heterogeneidades, que podrían dificultar la diferenciación a PDX1+ las células. Aquí, presentamos un protocolo detallado para distinguir hPSCs en PDX1+ las células. El protocolo consta de cuatro pasos e inicia la diferenciación de células disociadas siembra. La inducción de SOX17+ las células del endodermo definitivo fue seguida por la expresión de marcadores de tubo de intestino primitivo dos, HNF1β y HNF4α y eventual diferenciación en PDX1+ las células. El presente Protocolo proporciona fácil manejo y puede mejorar y estabilizar la eficiencia de la diferenciación de algunas líneas de hPSC que previamente fueron encontrados ineficazmente diferenciarse en linajes endodérmicos o PDX1+ las células.
Introduction
El páncreas principalmente consiste en las células exocrinas y endocrinas, y su disfunción o sobrecarga causa varias enfermedades, como la pancreatitis, diabetes y cáncer de páncreas. Para aclarar la patogenia de la pancreatopathy, es necesario analizar el proceso de desarrollo y la función de las células pancreáticas. Además, una fuente estable de la célula con sólida calidad es necesaria para establecer la terapia de suplementación de tejido de la célula. Célula de vástago de pluripotent humanas (hPSC)-derivado de las células pancreáticas son una fuente prometedora de células para estos fines, y el protocolo de diferenciación hacia células pancreáticas ha sido intensamente estudiado1,2,3, 4. Los recientes avances en la generación in vitro de las células β pancreáticas mímico la generación de las células β en adultos humanos y estas células Mostrar eficacia terapéutica sobre implante en modelo diabético ratones2,3. Además, el análisis de las células β generados a partir de las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) saludable los donantes paciente de diabetes tipo 1 no reveló ninguna diferencia funcional incluyendo cuando está bajo estrés5. Por otra parte, fenotipos de la enfermedad han sido parcialmente reproducidos en células pancreáticas inducidas con iPSCs derivados del paciente o hPSCs que las mutaciones genéticas en el mismo sitio que los pacientes6,7.
Para generar células pancreáticas de hPSCs, se utiliza la diferenciación dirigida paso a paso que recapitula los procesos de desarrollo. El páncreas se deriva de la capa del endodermo del embrión temprano, que expresa el sexo determina la región Y-caja 17 (SOX17) y forkhead cuadro A2 (FOXA2)8. Basado en los estudios con ratones, la capa endodermal forma el tubo intestino primitivo, que se caracteriza por la expresión de hepatocitos factor nuclear 1-beta (Hnf1β) y el factor nuclear de hepatocito 4-alfa (Hnf4α). El tubo intestino primitivo se alarga y se convierte en el aparato respiratorio, tracto digestivo y órganos. Después de la elongación, el área posterior del foregut se convierte la presunta región pancreática, y marcada por la expresión de la proteína del factor transcripcional páncreas/duodeno homeobox 1 (PDX1)8,9,10. Las partes dorsales y ventrales de la PDX1+ tubo intestinal espesar a brotes pancreáticos forma, que se caracterizan por la coexpresión de páncreas transcripción factor 1 subunidad alfa (PTF1A) y NK6 homeobox 1 (NKX6.1)8,11. Esta expresión marca el comienzo morfológico de la organogénesis pancreática. Las células del páncreas endodermo, que son componentes de las yemas pancreáticas, forman una red tubular ramificada de estructuras epiteliales12 y finalmente se diferencian en células exocrinas y endocrinas, incluyendo β-células secretoras de insulina y α-células secretoras de glucagón. Expresión de PDX1 se detecta primero en la región pancreática presuntiva, que luego se observa a lo largo de todo el desarrollo pancreático y muestra localización de las células β y δ9,13,14. Aunque el Pdx1+ área de células que no expresan Ptf1a o Nkx6.1 distingue en el antro gástrico, duodeno, vía biliar extrahepática y algunas células intestinales en el centro a la última etapa de desarrollo en ratones9, PDX1+ las células son consideradas los progenitores del páncreas en la primera etapa del desarrollo en seres humanos.
Aquí, presentamos un protocolo detallado para distinguir hPSCs en PDX1+ de las células para la generación de linajes pancreáticos. El protocolo inicia la diferenciación por la siembra disocia las células15,16,17. En general, hPSCs indiferenciadas se mantienen como colonias o agregados de células en suspensión o en la adhesión. Como resultado, la mayoría de protocolos inician la diferenciación poco después pases. Sin embargo, en el estado de colonias o agregados de células son propensas a heterogeneidades espaciales y transcripcional18,19,20,21,22, que podrían dificultar la primer paso de diferenciación hacia endodermo definitivo seguido por ineficiente diferenciación PDX1+ las células. El presente Protocolo puede ofrecer un manejo fácil para mejorar y estabilizar la eficiencia de la diferenciación de algunas líneas de hPSC que previamente fueron encontrados para distinguir ineficazmente a linajes endodérmicos y PDX1+ células23, 24 , 25.
Protocol
Representative Results
Discussion
La generación de PDX1+ células se compone de varios pasos; por lo tanto, es fundamental para el tratamiento de las células en el momento adecuado. Entre las medidas, la eficacia de la inducción del endodermo definitivo afecta en gran medida la eficacia de la inducción final, posiblemente por interferencia de otras células contaminantes linaje (es decir, mesodermo y ectodermo), que pueden proliferar o secretar factores interrumpir la diferenciación específica. Si la proporción de SOX17+ las …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por fondos de la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSP) a través de Scientific Research (C) (JSP KAKENHI Grant Number15K09385 y 18 K 08510) T.T. y subvenciones para investigadores de JSP (JSP KAKENHI número 17J07622) A.K., y la Agencia de Japón para la investigación médica y desarrollo (AMED) a través de su investigación conceder “Centro base para iPS red de centro de investigación para la realización de la medicina regenerativa, investigación con células” a K.O. Los autores agradecen a Dr. Peter Karagiannis por leer el manuscrito.
Materials
| 3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine | Toronto Research Chemicals | K171000 | CYC |
| 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid | Santa Cruz Biotechnology | SC-203303 | TTNPB |
| 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y] | Abcam | Ab76541 | Anti-CDX2, × 1/1000 dilution |
| B-27 Supplement (50 ×) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | Serum-free supplement |
| BD FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | For flow cytometry | |
| Biomedical freezer | SANYO | MDF-U538 | For -30 °C storing |
| Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-Chamber | BIO-RAD | 1450011 | Counting slide glass |
| CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEAR | Greiner bio-one | 657165 | For differentiation culture/6-well plate |
| Centrifuge | TOMY | AX-310 | For cell culturing |
| Centrifuge | TOMY | MX-305 | For RT-qPCR |
| CHIR99021 | Axon Medchem | Axon 1386 | |
| CLEAN BENCH | SHOWA KAGAKU | S-1601PRV | Clean bench |
| Corning CellBIND 6-well plate | Corning | 3335 | For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| Corning Synthemax II-SC Substrate | Corning | 3535 | For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs |
| Cryostat | Leica | Leica CM1510 S | For immunostaining of aggregates. |
| Cytofix/Cytoperm Kit | Becton Dickinson | 554714 | Perm/Wash buffer is Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer. |
| Dako pen | Dako | S2002 | For immunostaining of aggregates |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18427-088 | For RT-qPCR |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10040 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey Serum | Merck Millipore | S30 | Donkey serum |
| D-PBS(-) without Ca or Mg | Nacalai tesque | 14249-95 | DPBS |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium |
| Falcon 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 5 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer |
| Filter Tip, 1000 µL | Watoson | 124-1000S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 20 µL | Watoson | 124-P20S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 200 µL | Watoson | 124-P200S | Use together with pipettes |
| Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X700 | For immunostaining |
| Forma Steri-Cycle CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370A | Incubator |
| HNF-1β Antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7411 | Anti-HNF1β, × 1/200 dilution |
| HNF-4α Antibody (H-171) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8987 | Anti-HNF4α, × 1/200 dilution |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | For nucleus staining, × 1/200 dilution |
| Human Pancreas Total RNA | Ambion | AM7954 | For RT-qPCR |
| Human PDX-1/IPF1 Antibody | R&D Systems | AF2419 | Anti-PDX1, goat IgG, × 1/200 dilution |
| Human SOX17 Antibody | R&D Systems | AF1924 | Anti-SOX17, × 1/200 dilution |
| Improved MEM Zinc Option medium | Thermo Fisher Scientific | 10373-017 | iMEM |
| Incubation chamber | Cosmo Bio | 10DO | For immunostaining of aggregates |
| Latex Examination Gloves | Adachi | ||
| MAS coated slide glass | Matsunami Glass | 83-1881 | For immunostaining of aggregates |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | 4346907 | For RT-qPCR |
| Microscope | Olympus | CKX41N-31PHP | For cell culturing |
| Microtube | Watoson | 131-515CS | |
| Monoclonal Anti-α-Fetoprotein | SIGMA | A8452 | Anti-AFP, × 1/200 dilution |
| Nanodeop 8000 | Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Oligo dT | FASMAC | Custom made Oligo | For RT-qPCR of sequence is "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT" |
| Paraformaldehyde, powder | Nacalai tesque | 26126-54 | PFA, fixative, diluted in DPBS |
| Pharmaceutical refrigerator | SANYO | MPR-514 | For 4 °C storing |
| PIPETMAN P | GILSON | Pipette | |
| Recombinant Human KGF/FGF-7 | R&D Systems | 251-KG | KGF |
| Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | NOGGIN |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A | R&D Systems | 338-AC | Activin A |
| ReverTra Ace (100 U/μL) | TOYOBO | TRT-101 | For RT-qPCR |
| Rnase-Free Dnase Set (50) | QIAGEN | 79254 | For RT-qPCR |
| Rneasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | For RT-qPCR |
| RPMI 1640 with L-Gln | Nacalai tesque | 30264-85 | RPMI 1640 |
| Sealing Film for Real Time | Takara | NJ500 | For RT-qPCR |
| Serological pipettes 10 mL | Costar/Corning | 4488 | For cell culturing |
| Serological pipettes 25 mL | Costar/Corning | 4489 | For cell culturing |
| Serological pipettes 5 mL | Costar/Corning | 4487 | For cell culturing |
| Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb | Cell signaling | 3579S | Anti-SOX2, × 1/200 dilution |
| StepOnePlus | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Sucrose | Nacalai tesque | 30406-25 | For immunostaining of aggregates |
| TB Green Premix Ex Taq II |
Takara | RR820B | For RT-qPCR |
| TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450101J1 | Automatic cell counter |
| Tissue-Tek OCT compound 4583 | Sakura Finetechnical | 4583 | For immunostaining of aggregates |
| Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters | Sakura Finetechnical | 4566 | For immunostaining of aggregates |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Trypan Blue | BIO-RAD | 1450021 | |
| Ultracold freezer | SANYO | MDF-U33V | For -80 °C storing |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | Dilute with DPBS to prepare 0.5 mM EDTA |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Y-27632 | Wako | 251-00514 |
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