Эффективное поколения поджелудочной железы/двенадцатиперстную кишку гомеобокс белка 1+ задняя прародителями Передняя кишка/поджелудочной железы от hPSCs в культурах адгезии
Summary
Здесь мы представляем подробный протокол дифференцировать человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) в поджелудочной железы/двенадцатиперстную кишку гомеобокс белка 1+ (PDX1+) клетки для поколения поджелудочной железы линий на основе роста монослоя-колонии типа отделить одиночных клеток. Этот метод подходит для производства однородных клеток hPSC производные, генетические манипуляции и скрининг.
Abstract
Человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC)-производных клеток поджелудочной железы являются перспективный источник клеток для регенеративной медицины и платформу для изучения процессов человеческого развития. Шагам направлены дифференциации, резюмирует процессов развития является одним из основных способов создания клеток поджелудочной железы, включая поджелудочной железы/двенадцатиперстную кишку гомеобокс белка 1+ (PDX1+) поджелудочной железы прогениторных клеток. Обычные протоколы инициировать дифференциация с небольшими колониями вскоре после прохождения. Однако, в состоянии колоний или агрегатов, клетки подвержены неоднородностей, которые могут препятствовать дифференциации PDX1+ клеток. Здесь мы представляем подробный протокол дифференцировать hPSCs в PDX1+ клеток. Протокол состоит из четырех этапов и инициирует дифференциация по посевной диссоциированных одиночных клеток. Индукции SOX17+ окончательного эндодермы клеток последовал выражение двух примитивных кишки трубки маркеров, HNF1β и HNF4α и возможной дифференциации в PDX1+ клеток. Настоящий Протокол обеспечивает удобство в обращении и может улучшить и стабилизировать эффективность дифференциации некоторые hPSC линии, которые ранее были обнаружены неэффективно дифференцироваться в эндодермы линий или PDX1+ клеток.
Introduction
Поджелудочной железы в основном состоит из эндокринной и экзокринной клеток, и его дисфункции или перегрузка вызывает несколько заболеваний, таких как панкреатит, сахарный диабет и рак поджелудочной железы. Для выяснения патогенеза pancreatopathy, это необходимо для анализа процесса развития и функции клеток поджелудочной железы. Кроме того стабильные ячейки поставок с надежным качеством требуется учредить терапия добавок ткани клеток. Человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC)-производных поджелудочной железы клетки перспективный источник клеток для этих целей, и дифференциация протокол к клеток поджелудочной железы был интенсивно изучали1,2,3, 4. Последние достижения в в пробирке генерации клеток поджелудочной железы β имитировать генерации β-клеток взрослого человека, и эти клетки шоу терапевтической эффективности после имплантации в диабетической модели мышей2,3. Кроме того анализ β-клеток, генерируется индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) здоровых и тип 1 диабет пациентов доноров показал не функциональные различия, включая когда в условиях стресса5. Кроме того болезнь фенотипов были частично воспроизведены в искусственных клеток поджелудочной железы с пациента производные iPSCs или hPSCs, укрывательство генетические мутации в том же сайте, что пациенты6,7.
Для генерации клеток поджелудочной железы от hPSCs, используется поэтапный направленного дифференцирования, которая повторяет процессы развития. Поджелудочной железы является производным из энтодермы слоя раннего эмбриона, который выражает секс определение региона Y-бокс 17 (SOX17) и forkhead ящик А2 (FOXA2)8. Основываясь на исследованиях мыши, эндодермы слой образует примитивных кишки трубка, которая характеризуется выражением гепатоцит ядерного фактора 1-бета (Hnf1β) и гепатоцит ядерного фактора 4-альфа (Hnf4α). Примитивных кишки трубка удлиняется и развивается в органов дыхания и желудочно-кишечного тракта. После удлинения, передняя задняя кишка область становится регионе предполагаемого поджелудочной железы, как отмечено выражением transcriptional фактор поджелудочной железы/двенадцатиперстную кишку гомеобокс белка 1 (PDX1)8,9,10. Спинной и брюшной части PDX1+ кишки трубы утолщаются формы поджелудочной железы почки, которые отмечены одним выражением поджелудочной железы транскрипционного фактора 1 субблок альфа (PTF1A) и НК6 гомеобокс 18,(NKX6.1)11. Это выражение началу морфологических поджелудочной железы органогенеза. Поджелудочной железы эндодермы клеток, которые являются компонентами поджелудочной железы бутоны, формируют разветвленную сеть трубчатых эпителиальных структур12 и в конечном итоге дифференцироваться в эндокринной и экзокринной клетки, в том числе секреции инсулина β-клетками и Глюкагон секретирующих α-клетки. Выражение PDX1 обнаружен первый в регионе предполагаемого поджелудочной железы, который затем наблюдается на протяжении всего развития поджелудочной железы и показывает локализации для β – и δ-клетки9,,1314. Хотя Pdx1+ область ячейки, которая не выразить Ptf1a или Nkx6.1 отличает в желудка антрального, двенадцатиперстной кишки, кишечной клетки в середине на поздней стадии развития в мышей9, PDX1 и внепеченочных желчных протоков+ клетки, считаются прародителями поджелудочной железы на ранней стадии развития в организме человека.
Здесь мы представляем подробный протокол дифференцировать hPSCs в PDX1+ клетки для поколения поджелудочной железы линий. Дифференциация инициирует протокол путем заполнения отрыве одной клетки15,16,17. Как правило недифференцированные hPSCs поддерживаются как колоний или агрегаты клеток в суспензии или адгезии. В результате большинство протоколов инициировать дифференциация вскоре после пассированый. Однако, в состоянии колоний или агрегатов, клетки подвержены пространственных и transcriptional неоднородностей18,19,20,21,22, которые могли бы воспрепятствовать Первый шаг дифференциации в окончательное энтодермы следуют неэффективных дифференциации в PDX1+ клеток. Настоящий Протокол может предложить управляемость улучшить и стабилизировать эффективность дифференциации некоторые hPSC линии, которые были ранее признаны дифференцировать неэффективно эндодермы линий и PDX1+ клеток23, 24 , 25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Поколение PDX1+ клетки состоит из нескольких шагов; Таким образом крайне важно для лечения клетки в соответствующее время. Среди шагов эффективности индукции окончательного энтодермы во многом влияет на окончательный индукции эффективность, возможно, помехи от других загрязняющи…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана в части финансирования от японского общества для поощрения науки (JSP) через Scientific Research (C) (JSP-страницы KAKENHI Грант Number15K09385 и 18 K 08510) т.т., и субсидий для страниц JSP научных сотрудников (JSP-страницы KAKENHI номер гранта 17J07622) а.к., и Японское агентство для медицинских исследований и развития (AMED) через его исследования «Основной центр iPS исследования клеток, исследовательский центр сети для реализации регенеративной медицины» предоставить K.O. Авторы благодарят д-р Питер Karagiannis для чтения рукопись.
Materials
| 3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine | Toronto Research Chemicals | K171000 | CYC |
| 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid | Santa Cruz Biotechnology | SC-203303 | TTNPB |
| 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y] | Abcam | Ab76541 | Anti-CDX2, × 1/1000 dilution |
| B-27 Supplement (50 ×) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | Serum-free supplement |
| BD FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | For flow cytometry | |
| Biomedical freezer | SANYO | MDF-U538 | For -30 °C storing |
| Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-Chamber | BIO-RAD | 1450011 | Counting slide glass |
| CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEAR | Greiner bio-one | 657165 | For differentiation culture/6-well plate |
| Centrifuge | TOMY | AX-310 | For cell culturing |
| Centrifuge | TOMY | MX-305 | For RT-qPCR |
| CHIR99021 | Axon Medchem | Axon 1386 | |
| CLEAN BENCH | SHOWA KAGAKU | S-1601PRV | Clean bench |
| Corning CellBIND 6-well plate | Corning | 3335 | For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| Corning Synthemax II-SC Substrate | Corning | 3535 | For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs |
| Cryostat | Leica | Leica CM1510 S | For immunostaining of aggregates. |
| Cytofix/Cytoperm Kit | Becton Dickinson | 554714 | Perm/Wash buffer is Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer. |
| Dako pen | Dako | S2002 | For immunostaining of aggregates |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18427-088 | For RT-qPCR |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10040 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey Serum | Merck Millipore | S30 | Donkey serum |
| D-PBS(-) without Ca or Mg | Nacalai tesque | 14249-95 | DPBS |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium |
| Falcon 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 5 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer |
| Filter Tip, 1000 µL | Watoson | 124-1000S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 20 µL | Watoson | 124-P20S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 200 µL | Watoson | 124-P200S | Use together with pipettes |
| Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X700 | For immunostaining |
| Forma Steri-Cycle CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370A | Incubator |
| HNF-1β Antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7411 | Anti-HNF1β, × 1/200 dilution |
| HNF-4α Antibody (H-171) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8987 | Anti-HNF4α, × 1/200 dilution |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | For nucleus staining, × 1/200 dilution |
| Human Pancreas Total RNA | Ambion | AM7954 | For RT-qPCR |
| Human PDX-1/IPF1 Antibody | R&D Systems | AF2419 | Anti-PDX1, goat IgG, × 1/200 dilution |
| Human SOX17 Antibody | R&D Systems | AF1924 | Anti-SOX17, × 1/200 dilution |
| Improved MEM Zinc Option medium | Thermo Fisher Scientific | 10373-017 | iMEM |
| Incubation chamber | Cosmo Bio | 10DO | For immunostaining of aggregates |
| Latex Examination Gloves | Adachi | ||
| MAS coated slide glass | Matsunami Glass | 83-1881 | For immunostaining of aggregates |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | 4346907 | For RT-qPCR |
| Microscope | Olympus | CKX41N-31PHP | For cell culturing |
| Microtube | Watoson | 131-515CS | |
| Monoclonal Anti-α-Fetoprotein | SIGMA | A8452 | Anti-AFP, × 1/200 dilution |
| Nanodeop 8000 | Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Oligo dT | FASMAC | Custom made Oligo | For RT-qPCR of sequence is "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT" |
| Paraformaldehyde, powder | Nacalai tesque | 26126-54 | PFA, fixative, diluted in DPBS |
| Pharmaceutical refrigerator | SANYO | MPR-514 | For 4 °C storing |
| PIPETMAN P | GILSON | Pipette | |
| Recombinant Human KGF/FGF-7 | R&D Systems | 251-KG | KGF |
| Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | NOGGIN |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A | R&D Systems | 338-AC | Activin A |
| ReverTra Ace (100 U/μL) | TOYOBO | TRT-101 | For RT-qPCR |
| Rnase-Free Dnase Set (50) | QIAGEN | 79254 | For RT-qPCR |
| Rneasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | For RT-qPCR |
| RPMI 1640 with L-Gln | Nacalai tesque | 30264-85 | RPMI 1640 |
| Sealing Film for Real Time | Takara | NJ500 | For RT-qPCR |
| Serological pipettes 10 mL | Costar/Corning | 4488 | For cell culturing |
| Serological pipettes 25 mL | Costar/Corning | 4489 | For cell culturing |
| Serological pipettes 5 mL | Costar/Corning | 4487 | For cell culturing |
| Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb | Cell signaling | 3579S | Anti-SOX2, × 1/200 dilution |
| StepOnePlus | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Sucrose | Nacalai tesque | 30406-25 | For immunostaining of aggregates |
| TB Green Premix Ex Taq II |
Takara | RR820B | For RT-qPCR |
| TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450101J1 | Automatic cell counter |
| Tissue-Tek OCT compound 4583 | Sakura Finetechnical | 4583 | For immunostaining of aggregates |
| Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters | Sakura Finetechnical | 4566 | For immunostaining of aggregates |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Trypan Blue | BIO-RAD | 1450021 | |
| Ultracold freezer | SANYO | MDF-U33V | For -80 °C storing |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | Dilute with DPBS to prepare 0.5 mM EDTA |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Y-27632 | Wako | 251-00514 |
References
- D’Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Kondo, Y., Toyoda, T., Inagaki, N., Osafune, K. iPSC technology-based regenerative therapy for diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 9 (2), 234-243 (2017).
- Millman, J. R., et al. Generation of stem cell-derived beta-cells from patients with type 1 diabetes. Nature Communications. 7, 11463 (2016).
- Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
- Hosokawa, Y., et al. Insulin-producing cells derived from ‘induced pluripotent stem cells’ of patients with fulminant type 1 diabetes: Vulnerability to cytokine insults and increased expression of apoptosis-related genes. Journal of Diabetes Investigation. , (2017).
- Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
- Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
- Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
- Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
- Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
- Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochemical Journal. 310 (Pt 3), 997-1003 (1995).
- Riedel, M. J., et al. Immunohistochemical characterisation of cells co-producing insulin and glucagon in the developing human pancreas. Diabetologia. 55 (2), 372-381 (2012).
- Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367 (2013).
- Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
- Toyoda, T., et al. Rho-Associated Kinases and Non-muscle Myosin IIs Inhibit the Differentiation of Human iPSCs to Pancreatic Endoderm. Stem Cell Reports. 9 (2), 419-428 (2017).
- Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Nguyen, Q. H., et al. Single-cell RNA-seq of human induced pluripotent stem cells reveals cellular heterogeneity and cell state transitions between subpopulations. Genome Research. 28 (7), 1053-1066 (2018).
- Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 121 (3), 1217-1221 (2011).
- Rosowski, K. A., Mertz, A. F., Norcross, S., Dufresne, E. R., Horsley, V. Edges of human embryonic stem cell colonies display distinct mechanical properties and differentiation potential. Scientific Reports. 5, 14218 (2015).
- Torres-Padilla, M. E., Chambers, I. Transcription factor heterogeneity in pluripotent stem cells: a stochastic advantage. Development. 141 (11), 2173-2181 (2014).
- Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 14 (6), 357-368 (2013).
- Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
- Kimura, A., et al. Small molecule AT7867 proliferates PDX1-expressing pancreatic progenitor cells derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 24, 61-68 (2017).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).
- Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), (2015).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 109 (31), 12538-12543 (2012).
- Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson’s disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
- Suemori, H., et al. Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long-term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage. Biochemical and Biophysical Research Communication. 345 (3), 926-932 (2006).
- Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), e82076 (2013).
- Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
- Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
- Kelly, O. G., et al. Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 29 (8), 750-756 (2011).
- Hohwieler, M., et al. Human pluripotent stem cell-derived acinar/ductal organoids generate human pancreas upon orthotopic transplantation and allow disease modelling. Gut. 66 (3), 473-486 (2017).
- Takeuchi, H., Nakatsuji, N., Suemori, H. Endodermal differentiation of human pluripotent stem cells to insulin-producing cells in 3D culture. Scientific Reports. 4, 4488 (2014).
