Efficiënte generatie van alvleesklier/twaalfvingerige darm Homeobox eiwit 1+ Posterior voordarm/Pancreatic voorlopercellen van hPSCs in hechting culturen
Summary
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol te differentiëren van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) in de alvleesklier/twaalfvingerige darm homeobox eiwit 1+ (PDX1+) cellen voor de generatie van de alvleesklier lineages op basis van de niet-kolonie type enkelgelaagde groei van afzonderlijke cellen los. Deze methode is geschikt voor het produceren van homogene hPSC-afgeleide cellen, genetische manipulatie en screening.
Abstract
Menselijke pluripotente stamcellen (hPSC)-afgeleide pancreatic cellen zijn een veelbelovende bron van de cel voor regeneratieve geneeskunde en een platform om menselijke ontwikkelings processen te bestuderen. Stapsgewijs geregisseerd differentiatie die ontwikkelings processen recapituleert is een van de belangrijkste manieren om het genereren van pancreatic cellen, met inbegrip van de alvleesklier/twaalfvingerige darm homeobox eiwit 1+ (PDX1+) alvleesklier voorlopercellen. Conventionele protocollen starten de differentiatie met kleine kolonies kort na de passage. Echter, in de Braziliaanse deelstaat kolonies of geaggregeerd, cellen zijn gevoelig voor heterogeniteiten, die zouden kunnen de differentiatie naar PDX1 belemmeren+ cellen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol te differentiëren van hPSCs in PDX1+ cellen. Het protocol bestaat uit vier stappen en initieert de differentiatie door seeding gedissocieerde afzonderlijke cellen. De inductie van SOX17+ definitieve endoderm cellen werd gevolgd door de expressie van twee primitieve gut buis markeringen, HNF1β en HNF4α en eventuele differentiatie in PDX1+ cellen. Dit protocol biedt eenvoudige bediening kan verbeteren en stabiliseren van de efficiëntie van de differentiatie van hPSC regels die eerder werden gevonden om te differentiëren inefficiënt in endodermal lineages of PDX1+ cellen.
Introduction
De alvleesklier bestaat voornamelijk uit exocrine en endocriene cellen, en zijn dysfunctie of overbelasting veroorzaakt verschillende ziekten, zoals diabetes, pancreatitis en alvleesklierkanker. Om het verhelderen van de pathogeny van pancreatopathy, is het noodzakelijk om te analyseren de ontwikkelingstoxiciteit proces en functie van cellen van de alvleesklier. Daarnaast is de levering van een stabiele cel met robuuste kwaliteit vereist om de cellen/weefsels suppletie therapie. Menselijke pluripotente stamcellen (hPSC)-afgeleide pancreatic cellen zijn een veelbelovende cel bron voor deze doeleinden, en het protocol van de differentiatie naar pancreatic cellen is intensief bestudeerde1,2,3, 4. Recente vooruitgang in de in vitro generatie van cellen van de alvleesklier β bootsen de generatie van de β-cellen in menselijke volwassene, en deze cellen Toon therapeutische werking na implantatie in diabetische model muizen2,3. Bovendien, bleek het onderzoek van de β-cellen gegenereerd op basis van de geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) van gezonde en type 1 diabetes patiënt donoren geen functionele verschillen waaronder wanneer stress5. Ziekte fenotypen hebben bovendien gedeeltelijk weergegeven in geïnduceerde pancreatic cellen met patiënt afkomstige iPSCs of hPSCs herbergen genetische mutaties in dezelfde site als de patiënten6,7.
Voor het genereren van pancreatic cellen uit hPSCs, wordt stapsgewijze gestuurde differentiatie die ontwikkelings processen recapituleert gebruikt. De alvleesklier is afgeleid van de endoderm laag van het vroege embryo, die spreekt van geslacht bepalen regio Y-vak 17 (SOX17) en forkhead vak A2 (FOXA2)8. Op basis van de studies van de muis, vormt de endodermal laag de primitieve gut buis, die wordt gekenmerkt door de uitdrukking van de hepatocyte nucleaire factor 1-beta (Hnf1β) en hepatocyte nucleaire factor 4-alpha (Hnf4α). De primitieve gut buis kieuwopeningenvorm en ontwikkelt zich tot de respiratoire toestellen, maagdarmkanaal en organen. Na de rek, de achterste voordarm gebied wordt de vermoedelijke alvleesklier regio, zoals aangegeven door de expressie van het transcriptionele factor alvleesklier/twaalfvingerige darm homeobox eiwit 1 (PDX1)8,–9,10. De dorsale en ventrale delen van de PDX1+ gut buis dikker aan formulier alvleesklier toppen, die worden gekenmerkt door de co uitdrukking van alvleesklier transcriptie factor 1 subeenheid alpha (PTF1A) en NK6 homeobox 1 (NKX6.1)8,11. Deze expressie is de morfologische begin van alvleesklier organogenese. Alvleesklier endoderm cellen, die onderdelen van de alvleesklier toppen, vormen een vertakte buisvormige netwerk van epitheliale structuren12 en uiteindelijk in exocrine en endocriene cellen, met inbegrip van de β-cellen insuline-afscheidende onderscheiden en glucagon-afscheidende α-cellen. Uitdrukking van PDX1 wordt eerst gedetecteerd bij de vermoedelijke alvleesklier regio, die vervolgens wordt waargenomen gedurende de gehele ontwikkeling van de alvleesklier, en toont localization voor β – en δ-cellen9,13,14. Hoewel de Pdx1+ cel gebied dat doet niet express Ptf1a of Nkx6.1 onderscheidt in het antrum maag, twaalfvingerige darm, extrahepatic gal duct en sommige intestinale cellen in de midden tot late stadium van ontwikkeling in muizen9, PDX1+ cellen worden beschouwd als van de progenitoren van de alvleesklier de vroeg developmental stadium bij de mens.
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol te differentiëren van hPSCs in PDX1+ cellen voor de generatie van de alvleesklier geslachten. Het protocol initieert differentiatie door zaaien losgekoppeld afzonderlijke cellen15,16,17. In het algemeen, ongedifferentieerde hPSCs worden onderhouden als kolonies of cel aggregaten in suspensie of in hechting. Dientengevolge, starten de meeste protocollen de differentiatie kort na passaging. Echter, in de Braziliaanse deelstaat kolonies of geaggregeerd, cellen zijn gevoelig voor ruimtelijke en transcriptionele heterogeniteiten18,19,20,21,22, die zouden kunnen belemmeren de eerste stap van de differentiatie naar definitieve endoderm gevolgd door inefficiënte differentiatie naar PDX1+ cellen. Dit protocol kan bieden gemakkelijk te hanteren om te verbeteren en stabiliseren van de efficiëntie van de differentiatie van hPSC regels die eerder werden gevonden om te differentiëren inefficiënt aan endodermal geslachten en PDX1+ cellen23, 24 , 25.
Protocol
Representative Results
Discussion
De generatie van PDX1+ cellen bestaat uit meerdere stappen; Daarom is het essentieel voor het behandelen van cellen op het juiste moment. Onder de trappen, de efficiëntie van de inductie van definitieve endoderm grotendeels is van invloed op de efficiëntie van de laatste inductie, eventueel door interferentie van andere contaminerende lineage cellen (dat wil zeggen, mesoderm en ectoderm), die kan verspreiden en/of afscheiden factoren die specifieke differentiatie verstoren. Als het aandeel van de SOX17+…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de financiering uit de Society van Japan voor de promotie van wetenschap (JSPS) via Scientific Research (C) (JSPS KAKENHI Grant Number15K09385 en 18 K 08510) T.T. en Grant-in-Aid voor JSPS Research Fellows (JSPS KAKENHI Grant nummer 17J07622) A.K. en het Japan Agency voor medisch onderzoek en ontwikkeling (AMED) door middel van haar onderzoek toekennen “Core Center for iPS celonderzoek, Research Center netwerk voor realisatie van regeneratieve geneeskunde” K.O. De auteurs bedanken Dr. Peter Karagiannis voor het lezen van het manuscript.
Materials
| 3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine | Toronto Research Chemicals | K171000 | CYC |
| 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid | Santa Cruz Biotechnology | SC-203303 | TTNPB |
| 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y] | Abcam | Ab76541 | Anti-CDX2, × 1/1000 dilution |
| B-27 Supplement (50 ×) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | Serum-free supplement |
| BD FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | For flow cytometry | |
| Biomedical freezer | SANYO | MDF-U538 | For -30 °C storing |
| Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-Chamber | BIO-RAD | 1450011 | Counting slide glass |
| CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEAR | Greiner bio-one | 657165 | For differentiation culture/6-well plate |
| Centrifuge | TOMY | AX-310 | For cell culturing |
| Centrifuge | TOMY | MX-305 | For RT-qPCR |
| CHIR99021 | Axon Medchem | Axon 1386 | |
| CLEAN BENCH | SHOWA KAGAKU | S-1601PRV | Clean bench |
| Corning CellBIND 6-well plate | Corning | 3335 | For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| Corning Synthemax II-SC Substrate | Corning | 3535 | For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs |
| Cryostat | Leica | Leica CM1510 S | For immunostaining of aggregates. |
| Cytofix/Cytoperm Kit | Becton Dickinson | 554714 | Perm/Wash buffer is Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer. |
| Dako pen | Dako | S2002 | For immunostaining of aggregates |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18427-088 | For RT-qPCR |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10040 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey Serum | Merck Millipore | S30 | Donkey serum |
| D-PBS(-) without Ca or Mg | Nacalai tesque | 14249-95 | DPBS |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium |
| Falcon 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 5 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer |
| Filter Tip, 1000 µL | Watoson | 124-1000S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 20 µL | Watoson | 124-P20S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 200 µL | Watoson | 124-P200S | Use together with pipettes |
| Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X700 | For immunostaining |
| Forma Steri-Cycle CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370A | Incubator |
| HNF-1β Antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7411 | Anti-HNF1β, × 1/200 dilution |
| HNF-4α Antibody (H-171) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8987 | Anti-HNF4α, × 1/200 dilution |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | For nucleus staining, × 1/200 dilution |
| Human Pancreas Total RNA | Ambion | AM7954 | For RT-qPCR |
| Human PDX-1/IPF1 Antibody | R&D Systems | AF2419 | Anti-PDX1, goat IgG, × 1/200 dilution |
| Human SOX17 Antibody | R&D Systems | AF1924 | Anti-SOX17, × 1/200 dilution |
| Improved MEM Zinc Option medium | Thermo Fisher Scientific | 10373-017 | iMEM |
| Incubation chamber | Cosmo Bio | 10DO | For immunostaining of aggregates |
| Latex Examination Gloves | Adachi | ||
| MAS coated slide glass | Matsunami Glass | 83-1881 | For immunostaining of aggregates |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | 4346907 | For RT-qPCR |
| Microscope | Olympus | CKX41N-31PHP | For cell culturing |
| Microtube | Watoson | 131-515CS | |
| Monoclonal Anti-α-Fetoprotein | SIGMA | A8452 | Anti-AFP, × 1/200 dilution |
| Nanodeop 8000 | Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Oligo dT | FASMAC | Custom made Oligo | For RT-qPCR of sequence is "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT" |
| Paraformaldehyde, powder | Nacalai tesque | 26126-54 | PFA, fixative, diluted in DPBS |
| Pharmaceutical refrigerator | SANYO | MPR-514 | For 4 °C storing |
| PIPETMAN P | GILSON | Pipette | |
| Recombinant Human KGF/FGF-7 | R&D Systems | 251-KG | KGF |
| Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | NOGGIN |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A | R&D Systems | 338-AC | Activin A |
| ReverTra Ace (100 U/μL) | TOYOBO | TRT-101 | For RT-qPCR |
| Rnase-Free Dnase Set (50) | QIAGEN | 79254 | For RT-qPCR |
| Rneasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | For RT-qPCR |
| RPMI 1640 with L-Gln | Nacalai tesque | 30264-85 | RPMI 1640 |
| Sealing Film for Real Time | Takara | NJ500 | For RT-qPCR |
| Serological pipettes 10 mL | Costar/Corning | 4488 | For cell culturing |
| Serological pipettes 25 mL | Costar/Corning | 4489 | For cell culturing |
| Serological pipettes 5 mL | Costar/Corning | 4487 | For cell culturing |
| Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb | Cell signaling | 3579S | Anti-SOX2, × 1/200 dilution |
| StepOnePlus | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Sucrose | Nacalai tesque | 30406-25 | For immunostaining of aggregates |
| TB Green Premix Ex Taq II |
Takara | RR820B | For RT-qPCR |
| TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450101J1 | Automatic cell counter |
| Tissue-Tek OCT compound 4583 | Sakura Finetechnical | 4583 | For immunostaining of aggregates |
| Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters | Sakura Finetechnical | 4566 | For immunostaining of aggregates |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Trypan Blue | BIO-RAD | 1450021 | |
| Ultracold freezer | SANYO | MDF-U33V | For -80 °C storing |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | Dilute with DPBS to prepare 0.5 mM EDTA |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Y-27632 | Wako | 251-00514 |
References
- D’Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Kondo, Y., Toyoda, T., Inagaki, N., Osafune, K. iPSC technology-based regenerative therapy for diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 9 (2), 234-243 (2017).
- Millman, J. R., et al. Generation of stem cell-derived beta-cells from patients with type 1 diabetes. Nature Communications. 7, 11463 (2016).
- Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
- Hosokawa, Y., et al. Insulin-producing cells derived from ‘induced pluripotent stem cells’ of patients with fulminant type 1 diabetes: Vulnerability to cytokine insults and increased expression of apoptosis-related genes. Journal of Diabetes Investigation. , (2017).
- Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
- Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
- Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
- Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
- Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
- Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochemical Journal. 310 (Pt 3), 997-1003 (1995).
- Riedel, M. J., et al. Immunohistochemical characterisation of cells co-producing insulin and glucagon in the developing human pancreas. Diabetologia. 55 (2), 372-381 (2012).
- Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367 (2013).
- Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
- Toyoda, T., et al. Rho-Associated Kinases and Non-muscle Myosin IIs Inhibit the Differentiation of Human iPSCs to Pancreatic Endoderm. Stem Cell Reports. 9 (2), 419-428 (2017).
- Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Nguyen, Q. H., et al. Single-cell RNA-seq of human induced pluripotent stem cells reveals cellular heterogeneity and cell state transitions between subpopulations. Genome Research. 28 (7), 1053-1066 (2018).
- Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 121 (3), 1217-1221 (2011).
- Rosowski, K. A., Mertz, A. F., Norcross, S., Dufresne, E. R., Horsley, V. Edges of human embryonic stem cell colonies display distinct mechanical properties and differentiation potential. Scientific Reports. 5, 14218 (2015).
- Torres-Padilla, M. E., Chambers, I. Transcription factor heterogeneity in pluripotent stem cells: a stochastic advantage. Development. 141 (11), 2173-2181 (2014).
- Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 14 (6), 357-368 (2013).
- Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
- Kimura, A., et al. Small molecule AT7867 proliferates PDX1-expressing pancreatic progenitor cells derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 24, 61-68 (2017).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).
- Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), (2015).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 109 (31), 12538-12543 (2012).
- Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson’s disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
- Suemori, H., et al. Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long-term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage. Biochemical and Biophysical Research Communication. 345 (3), 926-932 (2006).
- Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), e82076 (2013).
- Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
- Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
- Kelly, O. G., et al. Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 29 (8), 750-756 (2011).
- Hohwieler, M., et al. Human pluripotent stem cell-derived acinar/ductal organoids generate human pancreas upon orthotopic transplantation and allow disease modelling. Gut. 66 (3), 473-486 (2017).
- Takeuchi, H., Nakatsuji, N., Suemori, H. Endodermal differentiation of human pluripotent stem cells to insulin-producing cells in 3D culture. Scientific Reports. 4, 4488 (2014).
