كفاءة توليد من البنكرياس/العفج هوميوبوكس البروتين 1+ الخلفي المعي/البنكرياس "موروث" من هبسكس في "الثقافات الالتصاق"
Summary
نقدم هنا، بروتوكول مفصل للتفريق بين الخلايا الجذعية البشرية pluripotent (هبسكس) في البنكرياس/العفج هوميوبوكس البروتين 1+ (PDX1+) الخلايا لتوليد الأنساب البنكرياس استناداً إلى النمو غير مستعمرة نوع أحادي الطبقة فصل الخلايا المفردة. هذا الأسلوب مناسبة لإنتاج الخلايا المستمدة من هبسك متجانسة، والتلاعب بالجينات والفرز.
Abstract
الخلية الجذعية pluripotent البشرية (هبسك)-مشتقة من خلايا البنكرياس مصدر خلية واعدة للطب التجديدي، ومنبرا لدراسة العمليات الإنمائية البشرية. Stepwise توجيه التمايز الذي يلخص العمليات الإنمائية واحدة من الطرق الرئيسية لتوليد خلايا البنكرياس بما في ذلك البنكرياس/العفج هوميوبوكس البروتين 1+ (PDX1+) خلايا البنكرياس السلف. بدء البروتوكولات التقليدية التمايز مع المستعمرات الصغيرة بعد المرور وقت قصير. ومع ذلك، في الدولة للمستعمرات أو المجاميع، الخلايا المعرضة للتغاير، التي قد تعوق التفرقة إلى PDX1+ الخلايا. نقدم هنا، بروتوكول مفصل للتفريق بين هبسكس في PDX1+ الخلايا. ويتكون من أربع خطوات البروتوكول ويبدأ التمايز ببذر خلايا مفردة معزولة. تحريض SOX17+ وأعقب خلايا الأنسجة نهائي التعبير عن علامات أنبوب القناة الهضمية البدائية اثنين و HNF1β و HNF4α، والتمايز في نهاية المطاف إلى PDX1+ الخلايا. هذا البروتوكول يوفر سهولة التعامل وقد تحسين واستقرار كفاءة تمايز بعض خطوط هبسك التي عثر عليها سابقا التفريق بين طريقة غير فعالة في الأنساب اندوديرمال أو PDX1+ الخلايا.
Introduction
البنكرياس يتكون بشكل رئيسي من خلايا إفرازات والغدد الصماء، وبه خلل أو الزائد يسبب العديد من الأمراض، مثل التهاب البنكرياس ومرض السكري وسرطان البنكرياس. لتوضيح pathogeny بانكريتوباثي، من الضروري تحليل العملية التنموية ووظيفة خلايا البنكرياس. وبالإضافة إلى ذلك، مطلوب على إمدادات مستقرة من خلية مع وجوده لإنشاء خلية/الأنسجة مكملات العلاج. الخلية الجذعية pluripotent البشرية (هبسك)-مشتقة من خلايا البنكرياس مصدر خلايا واعدة لهذه الأغراض، والبروتوكول التمايز تجاه خلايا البنكرياس وقد درس مكثف1،2،3، 4. التقدم الذي أحرز مؤخرا في توليد في المختبر من خلايا β البنكرياس تقليد توليد خلايا بيتا في الكبار البشرية، وهذه الخلايا تظهر الفعالية العلاجية على غرس في نموذج السكري الفئران2،3. وباﻹضافة إلى ذلك، كشف تحليل الخلايا β المتولدة من الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent (إيبسكس) في صحة جيدة والمانحين المريض السكري نوع 1 لا الاختلافات الوظيفية بما في ذلك عندما تحت الإجهاد5. وعلاوة على ذلك، تعمل المرض قد استنسخ جزئيا في خلايا البنكرياس المستحث مع إيبسكس المستمدة من المريض أو هبسكس إيواء الطفرات الوراثية في نفس الموقع كال6،المرضى7.
لإنشاء خلايا البنكرياس من هبسكس، يستخدم التمايز موجها التدرجي الذي يلخص العمليات الإنمائية. البنكرياس مشتق من طبقة الأنسجة للجنين المبكر، التي تعبر عن الجنس تحديد المنطقة Y-مربع 17 (SOX17) وفورخياد مربع A2 (FOXA2)8. استناداً إلى الدراسات الماوس، تشكل طبقة اندوديرمال أنبوب القناة الهضمية البدائية، التي تتميز بالتعبير عن تتمثل العوامل النووية 1-بيتا (Hnf1β) وتتمثل العوامل النووية 4-ألفا (Hnf4α). أنبوب القناة الهضمية البدائية الغضروفي ويطور في الجهاز التنفسي، والجهاز الهضمي، والأجهزة. بعد الإطالة، يصبح منطقة المعي الخلفي منطقة البنكرياس الظني، كما تميزت بالتعبير عن البروتين هوميوبوكس البنكرياس/العفج عامل النسخي 1 (PDX1)8،،من910. أجزاء الظهري والبطني PDX1+ القناة الهضمية أنبوب رشاقته على شكل براعم البنكرياس، التي تميزت بالتعبير المشترك عن البنكرياس النسخ عامل 1 ألفا فرعية (PTF1A) وهوميوبوكس NK6 18،(NKX6.1)11. ويعتبر هذا التعبير بداية المورفولوجية organogenesis البنكرياس. خلايا الأنسجة البنكرياس، ومكونات البراعم البنكرياس، تشكل شبكة أنبوبية متفرعة من هياكل الظهارية12 وتفرق في نهاية المطاف في إفرازات الغدد الصماء، والخلايا، بما في ذلك الخلايا β إفراز الأنسولين و إفراز الجلوكاجون α-الخلايا. التعبير عن PDX1 الكشف عن أولاً في منطقة البنكرياس الظني، ثم يلاحظ في جميع أنحاء تطوير البنكرياس كاملة، ويظهر التعريب إلى الخلايا β و δ9،،من1314. على الرغم من Pdx1+ يميز منطقة الخلية التي لا تعبر عن Ptf1a أو Nkx6.1 في التجويف المعدة والاثني عشر والقناة الصفراوية اكستراهيباتيك وبعض الخلايا المعوية في منتصف إلى أواخر مرحلة التنمية في الفئران9، PDX1+ وتعتبر الخلايا المتكفل البنكرياس في مرحلة النمو المبكر في البشر.
نقدم هنا، بروتوكول مفصل للتفريق بين هبسكس في PDX1+ الخلايا لتوليد الأنساب البنكرياس. التمايز بتهيئة البروتوكول قبل البذر فصل خلايا مفردة15،،من1617. عموما، يتم الاحتفاظ هبسكس غير متمايزة كمستعمرات أو المجاميع الخلية في التعليق أو في الالتصاق. كنتيجة لذلك، يبدأ معظم البروتوكولات المفاضلة بعد وقت قصير من باساجينج. ومع ذلك، في حالة المستعمرات أو المجاميع، الخلايا المعرضة للتغاير المكانية والنسخي18،19،20،،من2122، التي قد تعرقل خطوة أولى تمايز الأنسجة نهائي متبوعاً بتمايز الكفاءة إلى PDX1+ الخلايا. هذا البروتوكول قد يتيح سهولة التعامل لتحسين واستقرار كفاءة تمايز بعض خطوط هبسك التي عثر عليها سابقا التفريق بين كفاءة الأنساب اندوديرمال و PDX1 الخلايا+ 23، 24 , 25.
Protocol
Representative Results
Discussion
جيل PDX1+ الخلايا وتتألف من خطوات متعددة؛ ولذلك، من المهم لعلاج الخلايا في الوقت المناسب. ومن بين الخطوات، كفاءة التعريفي الأنسجة نهائي يؤثر إلى حد كبير على كفاءة التعريفي النهائي، وربما بتدخل من تلويث النسب الخلايا الأخرى (أي mesoderm والأديم الظاهر)، التي قد تنتشر و/أو إفراز العوامل الت?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل جزئيا بتمويل من “الجمعية اليابانية” لتعزيز العلوم (JSPS) عن طريق Scientific Research (C) (JSPS كاكينهي Number15K09385 المنح و 18 ك 08510) T.T.، ومعونات للزملاء الباحثين JSPS (JSPS كاكينهي عدد المنح 17J07622) لحزب العدالة والتنمية، والوكالة اليابانية “الأبحاث الطبية” والتنمية (AMED) من خلال بحوثه منح “مركز الأساسية للبرامج المتكاملة أبحاث الخلايا، شبكة مركز البحوث لتحقيق الطب التجديدي” كو يشكر المؤلفون الدكتور بيتر كاراجيانيس لقراءة المخطوطة.
Materials
| 3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine | Toronto Research Chemicals | K171000 | CYC |
| 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid | Santa Cruz Biotechnology | SC-203303 | TTNPB |
| 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y] | Abcam | Ab76541 | Anti-CDX2, × 1/1000 dilution |
| B-27 Supplement (50 ×) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | Serum-free supplement |
| BD FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | For flow cytometry | |
| Biomedical freezer | SANYO | MDF-U538 | For -30 °C storing |
| Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-Chamber | BIO-RAD | 1450011 | Counting slide glass |
| CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEAR | Greiner bio-one | 657165 | For differentiation culture/6-well plate |
| Centrifuge | TOMY | AX-310 | For cell culturing |
| Centrifuge | TOMY | MX-305 | For RT-qPCR |
| CHIR99021 | Axon Medchem | Axon 1386 | |
| CLEAN BENCH | SHOWA KAGAKU | S-1601PRV | Clean bench |
| Corning CellBIND 6-well plate | Corning | 3335 | For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| Corning Synthemax II-SC Substrate | Corning | 3535 | For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs |
| Cryostat | Leica | Leica CM1510 S | For immunostaining of aggregates. |
| Cytofix/Cytoperm Kit | Becton Dickinson | 554714 | Perm/Wash buffer is Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer. |
| Dako pen | Dako | S2002 | For immunostaining of aggregates |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18427-088 | For RT-qPCR |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10040 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey Serum | Merck Millipore | S30 | Donkey serum |
| D-PBS(-) without Ca or Mg | Nacalai tesque | 14249-95 | DPBS |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium |
| Falcon 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 5 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer |
| Filter Tip, 1000 µL | Watoson | 124-1000S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 20 µL | Watoson | 124-P20S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 200 µL | Watoson | 124-P200S | Use together with pipettes |
| Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X700 | For immunostaining |
| Forma Steri-Cycle CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370A | Incubator |
| HNF-1β Antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7411 | Anti-HNF1β, × 1/200 dilution |
| HNF-4α Antibody (H-171) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8987 | Anti-HNF4α, × 1/200 dilution |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | For nucleus staining, × 1/200 dilution |
| Human Pancreas Total RNA | Ambion | AM7954 | For RT-qPCR |
| Human PDX-1/IPF1 Antibody | R&D Systems | AF2419 | Anti-PDX1, goat IgG, × 1/200 dilution |
| Human SOX17 Antibody | R&D Systems | AF1924 | Anti-SOX17, × 1/200 dilution |
| Improved MEM Zinc Option medium | Thermo Fisher Scientific | 10373-017 | iMEM |
| Incubation chamber | Cosmo Bio | 10DO | For immunostaining of aggregates |
| Latex Examination Gloves | Adachi | ||
| MAS coated slide glass | Matsunami Glass | 83-1881 | For immunostaining of aggregates |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | 4346907 | For RT-qPCR |
| Microscope | Olympus | CKX41N-31PHP | For cell culturing |
| Microtube | Watoson | 131-515CS | |
| Monoclonal Anti-α-Fetoprotein | SIGMA | A8452 | Anti-AFP, × 1/200 dilution |
| Nanodeop 8000 | Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Oligo dT | FASMAC | Custom made Oligo | For RT-qPCR of sequence is "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT" |
| Paraformaldehyde, powder | Nacalai tesque | 26126-54 | PFA, fixative, diluted in DPBS |
| Pharmaceutical refrigerator | SANYO | MPR-514 | For 4 °C storing |
| PIPETMAN P | GILSON | Pipette | |
| Recombinant Human KGF/FGF-7 | R&D Systems | 251-KG | KGF |
| Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | NOGGIN |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A | R&D Systems | 338-AC | Activin A |
| ReverTra Ace (100 U/μL) | TOYOBO | TRT-101 | For RT-qPCR |
| Rnase-Free Dnase Set (50) | QIAGEN | 79254 | For RT-qPCR |
| Rneasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | For RT-qPCR |
| RPMI 1640 with L-Gln | Nacalai tesque | 30264-85 | RPMI 1640 |
| Sealing Film for Real Time | Takara | NJ500 | For RT-qPCR |
| Serological pipettes 10 mL | Costar/Corning | 4488 | For cell culturing |
| Serological pipettes 25 mL | Costar/Corning | 4489 | For cell culturing |
| Serological pipettes 5 mL | Costar/Corning | 4487 | For cell culturing |
| Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb | Cell signaling | 3579S | Anti-SOX2, × 1/200 dilution |
| StepOnePlus | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Sucrose | Nacalai tesque | 30406-25 | For immunostaining of aggregates |
| TB Green Premix Ex Taq II |
Takara | RR820B | For RT-qPCR |
| TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450101J1 | Automatic cell counter |
| Tissue-Tek OCT compound 4583 | Sakura Finetechnical | 4583 | For immunostaining of aggregates |
| Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters | Sakura Finetechnical | 4566 | For immunostaining of aggregates |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Trypan Blue | BIO-RAD | 1450021 | |
| Ultracold freezer | SANYO | MDF-U33V | For -80 °C storing |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | Dilute with DPBS to prepare 0.5 mM EDTA |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Y-27632 | Wako | 251-00514 |
References
- D’Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Kondo, Y., Toyoda, T., Inagaki, N., Osafune, K. iPSC technology-based regenerative therapy for diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 9 (2), 234-243 (2017).
- Millman, J. R., et al. Generation of stem cell-derived beta-cells from patients with type 1 diabetes. Nature Communications. 7, 11463 (2016).
- Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
- Hosokawa, Y., et al. Insulin-producing cells derived from ‘induced pluripotent stem cells’ of patients with fulminant type 1 diabetes: Vulnerability to cytokine insults and increased expression of apoptosis-related genes. Journal of Diabetes Investigation. , (2017).
- Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
- Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
- Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
- Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
- Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
- Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochemical Journal. 310 (Pt 3), 997-1003 (1995).
- Riedel, M. J., et al. Immunohistochemical characterisation of cells co-producing insulin and glucagon in the developing human pancreas. Diabetologia. 55 (2), 372-381 (2012).
- Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367 (2013).
- Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
- Toyoda, T., et al. Rho-Associated Kinases and Non-muscle Myosin IIs Inhibit the Differentiation of Human iPSCs to Pancreatic Endoderm. Stem Cell Reports. 9 (2), 419-428 (2017).
- Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Nguyen, Q. H., et al. Single-cell RNA-seq of human induced pluripotent stem cells reveals cellular heterogeneity and cell state transitions between subpopulations. Genome Research. 28 (7), 1053-1066 (2018).
- Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 121 (3), 1217-1221 (2011).
- Rosowski, K. A., Mertz, A. F., Norcross, S., Dufresne, E. R., Horsley, V. Edges of human embryonic stem cell colonies display distinct mechanical properties and differentiation potential. Scientific Reports. 5, 14218 (2015).
- Torres-Padilla, M. E., Chambers, I. Transcription factor heterogeneity in pluripotent stem cells: a stochastic advantage. Development. 141 (11), 2173-2181 (2014).
- Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 14 (6), 357-368 (2013).
- Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
- Kimura, A., et al. Small molecule AT7867 proliferates PDX1-expressing pancreatic progenitor cells derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 24, 61-68 (2017).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).
- Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), (2015).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 109 (31), 12538-12543 (2012).
- Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson’s disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
- Suemori, H., et al. Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long-term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage. Biochemical and Biophysical Research Communication. 345 (3), 926-932 (2006).
- Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), e82076 (2013).
- Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
- Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
- Kelly, O. G., et al. Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 29 (8), 750-756 (2011).
- Hohwieler, M., et al. Human pluripotent stem cell-derived acinar/ductal organoids generate human pancreas upon orthotopic transplantation and allow disease modelling. Gut. 66 (3), 473-486 (2017).
- Takeuchi, H., Nakatsuji, N., Suemori, H. Endodermal differentiation of human pluripotent stem cells to insulin-producing cells in 3D culture. Scientific Reports. 4, 4488 (2014).
