Generación de insulina libre de andamios, tridimensional expresar Pancreatoids de progenitores pancreáticos de ratón In Vitro
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para generar insulina expresando 3D pancreatoids murino de e10.5 flotante disociado progenitores pancreático y el mesenchyme asociado.
Abstract
El páncreas es que un órgano complejo compuesto de muchos diferentes tipos de células que trabajan juntas para regular la digestión y la homeostasis de la glucosa de sangre. Estos tipos de células son las células acinares secretoras de enzimas, un sistema ductal arborized responsable para el transporte de las enzimas de las células endocrinas de las tripas y la producción de hormonas.
Endocrino de las células beta son el tipo celular único en el cuerpo que producen insulina para bajar los niveles de glucemia. Diabetes, una enfermedad caracterizada por una pérdida o disfunción de células beta, está alcanzando proporciones epidémicas. Por lo tanto, es indispensable establecer protocolos para investigar el desarrollo de las células beta que puede utilizarse para fines de investigación para obtener los medicamentos y terapias basadas en células. Mientras que la investigación experimental del desarrollo del ratón es esencial, en vivo los estudios son laboriosos y lentos. Las células cultivadas ofrecen una plataforma más conveniente para la investigación; sin embargo, no son capaces de mantener la diversidad celular, organización arquitectónica y las interacciones celulares que se encuentran en vivo. Por lo tanto, es esencial para desarrollar nuevas herramientas para investigar la fisiología y la organogénesis pancreática.
Pancreáticas células epiteliales se desarrollan en la asociación cercana con el mesénquima del inicio de la organogénesis como células organizan y diferencian en el complejo órgano adulto fisiológicamente competente. El mesénquima pancreático proporciona señales importantes para el desarrollo endocrino, muchos de los cuales no son bien entendidos todavía, por lo tanto difícil recapitular durante el cultivo en vitro . Aquí, describimos un protocolo cultura ratón complejo tridimensional, celular organoides que retienen mesenchyme, denominado pancreatoids. El brote pancreático murino e10.5 es disecado, disociado y cultivado en un ambiente libre de andamio. Estos flotan células auto montan con mesénquima que envuelven el desarrollo pancreatoid y un número sólido de endocrina las células beta en desarrollo junto con el acinar y las células del conducto. Este sistema puede ser utilizado para estudiar las interacciones de célula célula célula sino determinación, organización estructural y morfogénesis, organogénesis, o de drogas, de molécula pequeña o screening genético.
Introduction
Delinear los mecanismos del desarrollo normal y la fisiología es primordial para entender la etiología de la enfermedad y, en definitiva, cultivar métodos de tratamiento. Mientras que el cultivo y diferenciación de células madre permiten el análisis rápido y alto rendimiento de desarrollo, está limitada por el cuerpo existente de conocimientos sobre mecanismos de regulación sino de la célula y artificialmente recapitula el desarrollo en un relativamente Estado homogéneo bidimensional1,2. En vivo desarrollo afectado por influencias extrínsecas, con diferentes tipos de células en el lugar y entorno proporciona señales paracrinas y apoyo organizativo para orientar la organogénesis, no sólo la función de estas células también se basa en su alrededores de dirección3,4,5. Dada la importancia de estos estímulos externos, las limitaciones de los protocolos de diferenciación y la naturaleza laboriosa de modelos de ratón en vivo , nuevos sistemas se necesitan para investigar experimentalmente la fisiología y los procesos básicos del desarrollo.
La aparición de protocolos para generar organitas tridimensional, complejo proporciona un sistema conveniente y congruente para el estudio de la organogénesis, fisiología, eficacia de los medicamentos e incluso patogenia. Establecer organitas murino para diferentes sistemas como el estómago intestino y6 7 han ampliado nuestra comprensión de la organogénesis, proporcionando una herramienta para estudiar las complejidades del desarrollo con menos restricciones que en vivo y en vitro modelos. Debido a estos avances en el organoide murino la formación y el advenimiento de humanas pluripotentes células, intestinal humano8, retina9, renal10,11, y organitas cerebral12 se han producido y esto repertorio es limitado solamente por el conocimiento existente respecto de los mecanismos de desarrollo.
De particular interés es la generación de pancreático organoides, como una miríada de enfermedades plagas diferentes pancreático tipos celulares, incluyendo células acinares y conductos en la escasez pancreática exocrine13, las células acinares en pancreatitis14, y células beta en la diabetes15. Adquirir conocimiento sobre el desarrollo de estos diferentes tipos de células podría ayudar en la comprensión de su patología y puede, también, actuar como una plataforma de screening de drogas personalizada o trasplante. Previamente, Greggio et al desarrollaron un método para crear murino organitas pancreático que recapitulan en vivo morfogénesis y desarrollan estructuras organizadas, tridimensionales, complejas compuesto por las principales células epiteliales pancreáticas los tipos de16,17. Este es un gran paso adelante en el área pancreático, sobre todo lo que hacen las células en vitro puede permitir investigación biológica del desarrollo de la célula beta. Sin embargo, una escasez de células endocrinas formados en este protocolo a menos que los organoides se trasplantaron en el tejido, donde el nicho podría interactuar y proporcionar señales de instrucción17. El mesénquima constituye la mayor parte del nicho, muy envolvente el epitelio en desarrollo desde etapas iniciales de la organogénesis para etapas posteriores incluyendo delaminación endocrino y diferenciación3,4, 18. La interacción de la mesénquima con el páncreas en desarrollo es otro ejemplo de señales extrínsecas y la importancia de mantener en vivo la complejidad celular para el estudio de la organogénesis.
Aquí, describimos cómo generar tridimensional organitas pancreático, llamado pancreatoids, de progenitores pancreáticos murinos disociado los e10.5. Estos pancreatoids retener mesénquima nativo, uno mismo-montar en condiciones libres y generar todos los tipos de células pancreáticas principales, incluyendo un número sólido de células endocrinas beta19. Este enfoque es más adecuado para el análisis del desarrollo endocrino, como protocolos anteriores carecen de diferenciación endocrina robusta. Sin embargo, usando el protocolo para páncreas organoides de Greggio et al. , es más adecuado para el análisis de la ramificación epitelial pancreático y morfogénesis, como ramificación es más limitada en pancreatoids.
Protocol
Representative Results
Discussion
La progresión de los modelos de cultura de célula es fundamental para desarrollo de modelos de correctamente, producir tipos de células clínicamente relevantes, prueba de eficacia de los medicamentos o incluso trasplante a los pacientes. Sin embargo, recapitulando artificialmente el desarrollo en un plato es todo un reto ya que estamos todavía lejos de comprender los mecanismos de la organogénesis y la fisiología en vivo. Así en vitro de las células son ineficaz generado, no completamente funci…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Jolanta Chmielowiec útil discusión sobre el protocolo y el manuscrito. También agradecemos a Benjamin Arenkiel acceso al microscopio confocal. Este trabajo fue financiado por los NIH (P30-DK079638 a m) y T32HL092332-13 de M.A.S. y M.B., la Fundación médica de McNair (a m) y el núcleo confocal en el BCM intelectual y discapacidades del desarrollo investigación centro (NIH U54 HD083092 de la Eunice Kennedy Shriver Instituto Nacional de salud infantil y desarrollo humano).
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| BarnStead NanoPure Nuclease-free water | ThermoFisher | D119 | |
| Borosilicate Capillary Tubes | Sutter Instruments | GB1007515 | O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cell-Repellent 96-Well Microplate | Greiner Bio-One | 650970 | U-bottom |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5401000013 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 233306 | |
| Chromogranin-A antibody | Abcam | ab15160 | |
| Compact, Modular Stereo Microscope M60 | Leica | ||
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10310 | |
| Countess Cell Counter Slides | Invitrogen | C10312 | |
| CryoStar NX70 | ThermoFisher | 957000L | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride) | Roche | 10 236 276 001 | Powder |
| DBA antibody | Vector Lab | RL-1032 | |
| Dispase II, Powder | Gibco | 17105041 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| Dnase I | Invitrogen | 18068-015 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | 0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip |
| EGF (Epidermal growth factor) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Laboratories | 2716 | |
| Forma Steri Cycle CO2 Incubators | ThermoFisher | 370 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | OB10001 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| INSM1 Antibody | Santa Cruz BioTechnology | sc-271408 | Polyclonal Mouse IgG |
| Isopropanol | Fisher | a4164 | |
| Isothesia Isoflurane, USP | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Insulin Antibody | Dako | A056401 | Polyclonal Guinea Pig |
| KAPA SYBR FAST Universal | KAPA Biosystems | KK4618 | |
| KCl | KaryoMax | 10575090 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | |
| Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal | Leica | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 442615 | |
| Mouse C-Peptide ELISA | ALPCO | 80-CPTMS-E01 | |
| Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA | ALPCO | 80-INSMSU-E01 | |
| MX35 Microtome Blades | ThermoFisher | 3052835 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S3817 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | ||
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Pdx1 antibody | DSHB | F6A11 | Monoclonal Mouse MIgG1 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | VWR | 15160-157 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Corning | MT30002CI | |
| PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22431081 | 1.5mL Capacity |
| Recombinant Human FGF-10 Protein | R&D Systems | 345-FG | |
| Recombinant Human FGF-Acidic | Peprotech | 100-17A | |
| Recombinant Human R-Spondin I Protein | R&D Systems | 4546-RS | |
| BenchRocker 2D | Benchmark | BR2000 | |
| Sucrose 500g | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Super Pap Pen | Electron Microscopy Sciences | 71310 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 05-412-401 | |
| Tissue Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604039 | (1x), no Phenol Red |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | 15250061 | For cell counting slides |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | 25-052-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200072 | Phenol Red |
| Ultra-Low Attachment 24-Well Plate | Corning | 3473 | |
| Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well | Corning | 4520 | |
| Vimentin Antibody | EMD Millipore | AB5733 | Polyclonal Chicken IgY |
| Vortex Genie | BioExpres | S-7350-1 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | R&D Systems | 1254 | Also known as ROCK inhibitor |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss |
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