עמוק עורי הזרקת כמו מודל של קנדידה אלביקנס דלקת עור עבור ניתוחים היסטולוגית
Summary
כאן נתאר פרוטוקול המאפשר ניתוח היסטולוגית ומולקולרית של דגימות עור לאחר ההזרקה intradermal קנדידה אלביקנס . פרוטוקול זה שומר על שלמות המבנה של העור ומאפשר הלוקליזציה של תאים חיסוניים רקמות-תושב או שזה עתה מגויסים, כמו גם את ההתפלגות הפתוגן.
Abstract
העור הוא איבר מאוד מורחבת של הגוף, עקב זה משטח גדול, ללא הרף ייחשף מיקרואורגניזמים. נזק לעור יכול בקלות להוביל דלקות הדרמיס והתוצאה בתורו, יכול, להיות הפצת פתוגנים למחזור הדם. הבנת איך מערכת החיסון נלחם זיהומים בשלב מוקדם מאוד, איך המחשב המארח יכול לחסל פתוגנים היא צעד חשוב כדי להגדיר את הבסיס עבור התערבויות טיפוליות עתידיות. כאן נתאר מודל של זיהום קנדידה אלביקנס שיכולים להמחיש את התהליכים המתרחשים מוקדם במהלך זיהום, כולל בעת המחלה עברה את מחסום האפיתל, כמו גם את התגובה החיסונית שהפיק את אלביקנס ג הפלישה. השתמשנו מודל זיהום זה כדי לבצע ניתוח היסטולוגית המציגים את התאים החיסוניים זה לחדור את העור, כמו גם את הנוכחות ואת לוקליזציה של המחלה. הדגימות שנאספו לאחר הזיהום ניתן לעבד לחילוץ RNA.
Introduction
גוף האדם מכוסה עם מספר גבוה מאוד של מיקרואורגניזמים. לפני השטח של העור הוא בית הגידול של כמעט מיליון חיידקים לכל סנטימטר מרובע1. מספר זה, עם זאת, אינו משקף על המגוון המלא של מיקרואורגניזמים והצנרות העור. בנוסף חיידקים, גוף האדם הוא התנחלו על ידי מינים פטרייתי רבים, כולל אלביקנס ג, שזה מסוגל לשרוד הן את הרירית והן את העור ברמה2.
בשנים האחרונות גדל מאוד האחוז של אנשים שאובחנו עם זיהומים פטרייתיים. זאת בעיקר בשל העלייה במספר אנשים immunocompromised, קרי, חולי HIV-חיובי. וכלפי מטופלים עברו כימותרפיה או תרופות לדיכוי המערכת החיסונית לאחר השתלת3. במחקר מעקב שנערך בארצות הברית, Wisplinghoff. et al. הראה כי 9.5% של זיהומים nosocomial למחזור הדם שנגרמו על ידי זנים של קנדידה 4. עקב המופע מוגברת של זיהומים פטרייתיים, במיוחד בגלל האחוז מוגברות של קנדידה מינים נמצאו במהלך זיהומים למחזור הדם, הבנת איך הפתוגן הזה בורח השליטה של מערכת החיסון היא מאוד חשוב.
ג אלביקנס הוא בפטריה dimorphic שגדלה בצורות מורפולוגיות שונות כגון שמרים, blastospores, pseudohyphae ו- hyphae בהתאם לתנאים סביבתיים5. בצורתו hyphal, אלביקנס ג מציג את הקיבולת הגבוהה שלו invasiveness ויש לו את היכולת לחדור את אפיתל6.
זיהומים אלביקנס ג נחקרו באמצעות מספר גישות ניסיוניות. המודל הנפוץ ביותר של זיהום הוא הזרקה תוך ורידי של שמרים אלביקנס ג 7. עם זאת, מודל זה לא להתחשב בכל התהליכים זה יקרה לפני הפטריה מצליח להתפשט למחזור הדם. מודל נוסף מנצל היכולת של אלביקנס ג לפלוש האפיתל. בשיטה זו, המכונה גם נייר דגם8, פותחה על ידי Gaspari et al. . ב 19989, מורכב באמצעות נייר חול כדי תשפשפו את העור, וכך למנוע את הקרנית לפני החלת אלביקנס ג. הליך זה מאפשר את הפטרייה לחדור האפיתל, ובכך מאפשר ניתוח פולשני ביכולות של הפתוגן הזה. לבסוף, דגמים אחרים של זיהומים במערכת העיכול10 ו כלי הנשימה11 השתמשו במחקרים שונים.
היווצרות פצע (כמו דגם נייר חול) גורמת את ההפעלה של כמה מסלולים, כולל תא החיסון גיוס והפעלה, על מנת לקדם את תהליך הריפוי12. זה יכול לשנות או להסתיר את התגובה החיסונית במיוחד elicited נגד המחלה, ובכך מוביל משתנה מתערב תוצאות.
כאן נתאר שיטת דלקת עור זה מונע היווצרות פצע הראשונית ואת של אינדוקציה של סביבה דלקתית הבזליים. כדי לשמור על המבנה אפיתל ללא פגע, ישירות נזריק אלביקנס ג בצורתה hyphal ב למחרת היום עמוק. אף-על-פי זריקה אחת יכול להפיק דלקת קלה, הכמות של דלקת מוגבלת, מוגבל לעומת היווצרות פצע פתוח כמו דגם נייר חול. הגישה כי אנו מתארים כאן מאפשר המחקר של התגובה החיסונית לזיהום פטרייתי, התפשטה תוך הימנעות הסביבה דלקתית מוגזמת ולא קיימים נגרם נזק מכני.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנחנו תיאר שיטה של זיהום אלביקנס ג ללמוד תהליך דלקתי שמאותחלת הכניסה פטרייתי ב למחרת היום עמוק.
אף-על-פי להצטברות של העור הוא אירוע נדיר יחסית על זיהום אלביקנס ג 15, הזרקה של הפטרייה ישירות בלמחרת היום עמוק מאפשר לא רק חקר היווצרות מורסה מונחה-פטריי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
FG נתמכת על ידי Associazione Italiana לכל החיפוש אחר לה סול Cancro (IG 2016Id.18842), קרן Cariplo (גרנט 2014-0655) דל’אנג’לו Regionale לכל la החיפוש אחר Biomedica (FRRB).
איז נתמך על-ידי NIH גרנט 1R01AI121066-01A1, 1R01DK115217, HDDC P30 DK034854 גרנט, הרווארד בית הספר לרפואה מילטון נמצאו פרסי מחקר בכיר CCFA (412708), אלינור, החוף Miles תכנית העמיתים יום הנישואין ה-50 שלהם, את (קרן Cariplo 2014-0859).
Materials
| Reagents | |||
| PBS | Euroclone | ECB4053L | warm in 37 °C bath before use |
| H-OCT compound | histo-line laboratories | R0030 | |
| Gill's Hematoxilyn | histo-line laboratories | 09-178-2 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | histo-line laboratories | 09-209-05 | |
| Ethanol absolute | scharlau | ET00232500 | |
| Citro-HISTOCLEAR | histo-line laboratories | R0050 | |
| Eukitt, mounting medium | bio-optica | ||
| Acetone | sigma-aldrich | 179124 | |
| PAS staining system | sigma-aldrich | 395B-1KT | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology | Applichem PanReac | 50-99-7 | |
| Uridine | Merck Millipore | 8451 | |
| HEPES | Applichem PanReac | A1070,0500 | |
| Safe-Lock tubes 2 mL | eppendorf | 30121597 | |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596018 | Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed |
| Rneasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| liquid nitrogen | Wear eye protection | ||
| Instrument | |||
| Coulter Counter-Particle Count | Beckman Coulter | ||
| Centrifuge 5415 R | eppendorf | ||
| MC 3000 Microtome Cryostat | histo-line laboratories | ||
| TissueLiser | QIAGEN | ||
| Materials | |||
| 0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle | BD | 324826 | |
| Surgical forceps | |||
| Surgical scissors | |||
| Base mould disposable | histo-line laboratories | 2781 | |
| Positively charged bio microscope slides | bio-optica | 09-2000 | |
| Cover slips 24 x 50 mm | thermo scientific | 11911998 |
References
- Belkaid, Y., Segre, J. A. Dialogue between skin microbiota and immunity. Science. 346 (6212), 954-959 (2014).
- Kashem, S. W., Kaplan, D. H. Skin Immunity to Candida albicans. Trends Immunol. 37 (7), 440-450 (2016).
- Havlickova, B., Czaika, V. A., Friedrich, M. Epidemiological trends in skin mycoses worldwide. Mycoses. 51, 2-15 (2008).
- Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. Nosocomial Bloodstream Infections in US Hospitals: Analysis of 24,179 Cases from a Prospective Nationwide Surveillance Study. Clin Infect Dis. 39 (3), 309-317 (2004).
- Romani, L. Immunity to fungal infections. Nat Rev Immunol. 4 (1), 11-24 (2004).
- Odds, F. C. Pathogenesis of Candida infections. J Am Acad Dermatol. 31 (3), S2-S5 (1994).
- MacCallum, D. M., Odds, F. C. Temporal events in the intravenous challenge model for experimental Candida albicans infections in female mice. Mycoses. 48 (3), 151-161 (2005).
- Dai, T., Kharkwal, G. B., Tanaka, M., Huang, Y. -. Y., Bil de Arce, V. J., Hamblin, M. R. Animal models of external traumatic wound infections. Virulence. 2 (4), 296-315 (2018).
- Gaspari, A. A., Burns, R., Nasir, A., Ramirez, D., Barth, R. K., Haidaris, C. G. CD86 (B7-2), but not CD80 (B7-1), expression in the epidermis of transgenic mice enhances the immunogenicity of primary cutaneous Candida albicans infections. Infect Immun. 66 (9), 4440-4449 (1998).
- Koh, A. Y. Murine models of Candida gastrointestinal colonization and dissemination. Eukaryot Cell. 12 (11), 1416-1422 (2013).
- Mear, J. B., et al. Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response. Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2014).
- Leoni, G., Neumann, P. -. A., Sumagin, R., Denning, T. L., Nusrat, A. Wound repair: role of immune-epithelial interactions. Mucosal Immunol. 8 (5), 959-968 (2015).
- Fonzi, W. A., Irwin, M. Y. Isogenic strain construction and gene mapping in Candida albicans. Genetics. 134 (3), 717-728 (1993).
- Santus, W., et al. Skin infections are eliminated by cooperation of the fibrinolytic and innate immune systems. Sci Immunol. 2 (15), (2017).
- Florescu, D. F., Brostrom, S. E., Dumitru, I., Kalil, A. C. Candida albicans Skin Abscess in a Heart Transplant Recipient. Infect Dis Clin Pract. 18 (4), 243-246 (2010).
- Pradeu, T., Cooper, E. L. The danger theory: 20 years later. Front Immunol. 3, 287 (2012).
- Cheng, A. G., DeDent, A. C., Schneewind, O., Missiakas, D. A play in four acts: Staphylococcus aureus abscess formation. Trends Microbiol. 19 (5), 225-232 (2011).
