פפטידים מיקרוביאלית המיוצר על ידי ההתאגדות הלחץ הסלקטיבי של חומצות אמינו קאנונית
Summary
הפרוטוקול מציג את Escherichia coli-המבוסס על הלחץ הסלקטיבי השתלבות של חומצות אמינו קאנונית (ncAAs) nisin פפטיד מיקרוביאלית lactococcal. ניתן לשנות את מאפייניו במהלך רקומביננטי ביטוי באמצעות החלפת עם ncAAs הרצוי בתקשורת צמיחה מוגדרים. השינויים הנובעים מכך באתריים ממופים על ידי הצמיחה עיכוב מבחני פלורסצנטיות מיקרוסקופ.
Abstract
לטבע יש מגוון של אפשרויות ליצירת חלבון פונקציות חדשות על-ידי שינוי הרצף של אבני הבניין חומצת אמינו בודדות. עם זאת, כל הווריאציות מבוססים על 20 הקנוני חומצות אמינו (cAAs). דרך להציג מאפיינים נוספים physicochemical לתוך polypeptides, שילוב של חומצות אמינו קאנונית (ncAAs) משמשת יותר ויותר בהנדסת חלבונים. בשל אורכם הקצר יחסית, השינוי של פפטידים מסונתז ribosomally, post-translationally ששונה על-ידי ncAAs הוא אטרקטיבי במיוחד. פונקציונליות חדשה וידיות כימי יכול להיווצר על ידי שינויים ספציפיים של שאריות בודדים. השיטה ההתאגדות (SPI) הלחץ הסלקטיבי מנצל שמקודדים המארח auxotrophic הם משוללי חומצת אמינו חיונית בתקשורת צמיחה מוגדרים כימי. מספר תחליפי חומצת אמינו דומים מבחינה מבנית רחמנא ליצלן אז יכול להיות מופעל על ידי המעביר-aminoacyl-tRNA המתאים ומספקים ספציפיים שאריות cAA(s) ← ncAA(s) ההחלפות ברצף פפטיד או חלבון המטרה. למרות זאת, בהקשר של השיטה SPI, ncAAs גם משולבים פרוטאום מארח בשלב של ביטוי גנים רקומביננטי, רוב המשאבים של התא מוקצות הביטוי של הגן היעד. פעולה זו מאפשרת שאריות ספציפי יעיל, תיאגוד ncAAs מלווה לעיתים קרובות עם כמויות גבוהות של יעד שונה. העבודה הציג מתאר את ויוו השתלבות של שישה פרולין תחליפי פפטיד מיקרוביאלית nisin, lantibiotic המיוצר באופן טבעי על ידי lactis הכרוכים. מאפיינים מיקרוביאלית של nisin ניתן לשנות, הרחיב במהלך התסיסה שלו, ביטוי auxotrophic Escherichia coli זנים בתקשורת צמיחה מוגדרים. ובכך, ההשפעות של החלפת ספציפיים שאריות של cAAs עם ncAAs יכול לספק שינויים ב פעילות מיקרוביאלית וספציפיות. מבחני פעילות מיקרוביאלית, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות משמשים כדי לבדוק את גרסאות nisin חדשות עבור עיכוב גדילה של זן מחוון גראם חיוביים lactis הכרוכים . לספקטרומטרית משמש כדי לאשר התאגדות המכללות nisin ביואקטיביות משתנים.
Introduction
הגילוי של אנטיביוטיקה במאה העשרים, פיתוח מקביל של תרכובות חדשות מיקרוביאלית כנגד מיקרואורגניזמים פתוגניים מופעלת לפלח טיפולים של זיהומים חיידקיים. עם זאת, בשל הופעתה של פתוגנים multidrug עמידים כגון סטפילוקוקוס עמיד methicillin- Staphylococcusaureus (MRSA), enterococci vancomycin עמידים (VRE), הקלד MDR (multidrug עמידים) סלמונלה typhimurium phage 10 (DT10 ), קלבסיאלה pneumoniae, זה הכרחי ליצור antimicrobial סוכנים חדשים1. פפטידים מיקרוביאלית (אמפר) הם תרכובות רב צדדי, ספציפי לעיתים קרובות מאוד מבטיח מועמדים הפיתוח של תרופות חדשות בזכות תכונותיהם physicochemical, גמישות, גודל, hydrophobicity, ואת מצב של פעולה2. מגברים הם פפטידים קטן המורכב בדרך כלל 7-100 חומצות אמינו. לעתים קרובות, יש להם מבנה cationic עשיר הטעון חיובית שאריות ארגינין, ליזין, אשר אינטראקציה עם קרום התא יישוב חיידקים, אשר מחויב הפוך3. קבוצת משנה מסוימת של המגברים הינם פפטידים ribosomally מסונתז, ששונה posttranslationally (RiPPs)4. אלה מיוצרים על ידי אורגניזמים רבים מן הממלכה של פטריות, התחום של חיידקים. אחד RiPPs הידוע והשימוש בהם נפוץ הוא nisin, המיוצר באופן טבעי על ידי החיידק חומצה לקטית הכרוכים lactis (lactis ל’). פעיל נגד פאנל של חיידקים גראם חיוביים, nisin שימש בתור biopreservative בתעשיית המזון יותר מ-50 שנה בשל תכונותיו מיקרוביאלית ואת העדר התנגדות מפותחת בכל יישוב זני חיידקים5. מחקרים הראו nisin הזה שיערער ומייצר נקבוביות בחיידקיים קרום התא, שמוביל פעילות מיקרוביאלית נגד שני פתוגנים גראם גראם שליליים ו-6. באמצעות קשירה השומנים II, סינתזה הקיר תא החיידק הוא מאופק7. Nisin מקודד על ידי nisA כמו פפטיד קודמן ליניארי, אשר מורכב של מנהיג, אזור פפטיד הליבה (איור 1). לאחר סינתזה ribosomal, prenisin קודם שינה את dehydratase NisB. כאן, סרין, תראונין משקעים באזור הליבה prepeptide הם יבשים dehydroalanine (Dha), dehydrobutyrine (Dhb)8. לאחר מכן, משקעי מיובשת נמצאים ביחד עם ציסטאין טופס lanthionine טבעות (ומכאן השם “lantibiotic” lanthionine המכילים טבעת אנטיביוטיקה) על ידי תוספת מייקל מזורז-אנזים. את השינוי posttranslational (PTM) הוא מזורז על ידי cyclase NisC. ב- lactis ל’, prenisin ששונה מועבר מכן מחוץ לתאים על-ידי טרנספורטר NisT ולאחר פפטיד המנהיג הוא ביקע מאת proteinase NisP לשחרר את הטופס הפעיל ובוגרת nisin9. מנהיג אחראי peptidase NisP יש ירידה לפרטים המצע גבוה, מאז זה רק תהליכי שינוי nisin ביעילות10.
באופן כללי, פעיל RiPPs תוצאה של הפעולה של אנזימים PTM (למשל NisBC), אשר באופן דרסטי להגדיל את שטח הכימית של פפטידים קצרים, למשל, דרך acetylation, גליקוזילציה, מתילציה או זירחון. רמה זו של מורכבות נוספת ניתן להרחיב באמצעות שילוב ישיר של ncAAs. אמנם לעתים קרובות ריאלי, סינתזה של מגברים הוא אתגר עבור ייצור בקנה מידה גדול עקב המורכבות מבניים שלהם. לדוגמה, סינתזה כימית סך של lactosin lantibiotic S בשלבים תגובה 71 הושגה עם תשואה הסופי של 10% וזו של nisin עם תשואה גולמי בלבד 0.003%11,12. לכן, ייצור ביולוגי מציע אלטרנטיבה מעשית, בגלל הדור stereocenters נכונה וריכוז מוצר גבוהה.
עד היום, יותר מ 150 ncAAs, למשל, שיש קבוצות פונקציונליות המכילים פלואור או azides, שולב חומרים ולאחר מספר דוגמאות של מגברים המכללות-השתנה כבר דווח על13,14, 15,16. עם כניסתה של ncAAs, מאפיינים physicochemical הרומן ניתן להפיק בהשוואה מוטגנזה מכוונת קונבנציונלי. המגוון של פפטידים הקיים יכול להיות מוגברת, שיכול להוביל אנטיביוטיקה הרומן.
שיטה אחת עבור שילוב של ncAAs לתוך פפטידים רקומביננטי היא התאגדות הלחץ הסלקטיבי (SPI) מבוסס על השימוש של זני חיידקים auxotrophic17. זנים אלו אינם מסוגלים לסנתז אנלוגי לפנות לסוכנות המקביל של ncAA. המתודולוגיה משתמש יחודיות הנצפה לעתים קרובות המצע רגועה, תכונה של aminoacyl הטבעי-tRNA רבים synthetases (aaRSs)18. מלבד מצעים לפנות לסוכנות הטבעי שלהם, אנזימים אלה לעיתים קרובות מסוגל לזהות ולהפעיל את המכללות הרצוי, כדי לטעון את זה על tRNA(s) cognate שלהם. זה מוביל ribosomal תיאגוד ncAA לתוך המוצר ג’ין היעד באופן ספציפי שאריות (קרי, לפנות לסוכנות ← ncAA החלפה). זה כמובן אפשרי רק כאשר ncAA הרצויה היא מבנית רחמנא ליצלן דומה לחומצה אמינית הקנוני, נסבל על ידי הפיזיולוגיה של התא, את מכונות תרגום ואת הרצף פפטיד או חלבון המטרה. ב מבנה ניסיוני מסוים, התאים מארח auxotrophic מתורבתים במדיום מוגדר מסופק עם ריכוז חומצת אמינו מקורית ביותר שיוחלפו המגביל. צמיחה סלולרי או exchange על-ידי מדיום נטול לפנות לסוכנות מובילה אל תאיים דלדול של המנהל האזרחי. בשלב הבא, ncAA נוסף, בביטוי הגן היעד הוא המושרה. באופן בלתי נמנע, ncAAs עכשיו גם משולבים בחלבונים רבים אחרים בתא המארח במהלך שלב זה היעד גנים. למרות זאת, הרעילות של ההתקנה SPI נשמרת ברמה נמוכה מאז המתח Escherichia coli (e. coli) משתנה עם פלסמיד נושא את הגן המטרה תחת שליטה של מקדם מכירות חזק (נפוץ מקדם T7 תחרותי / מערכת ה-RNA פולימראז)19. מיד לאחר אינדוקציה (בדרך כלל כאשר המנהל האזרחי הוא מותש), המארח תאים חדל לצמוח, machineries אנזימטי cytoplasmic שלהם משמשים בעיקר עבור ביטוי הגן מבוססת על פלסמיד היעד. מוטגנזה ניתן להגדיר את האתר של שאריות ספציפיים ncAA התקנת ג’ין היעד20.
כמו פפטיד מודל עבור שילוב של ncAAs, nisin כח pentacyclic A נבחר. 34 חומצות אמינו ארוך ויש רק משקע פרולין בודדת ברצף פפטיד הליבה (איור 1). כמו סבטיליזין ericin A, S, כמו גם epidermin nisin Z, nisin Q, פרולין שנשמרת נראה חיוני עבור פעילות9,21. פרולין לפנות לסוכנות ממלאת תפקיד חשוב במיוחד peptidyl-prolyl אמיד סיבוב וייצוב מבנה שניוני. שרשרת הצד שלו מצלצל הייצורים החיים (exo / אנדו קימוט) אחראים על ייצוב תרמודינמי ההדבקה אמיד. שינויים כימיים יישוב (כגון hydroxylations, fluorinations, methylations) של prolyl קימוט להשפיע לעיתים קרובות באופן ביקורתי את יציבות מתקפלים, קשיחות לגרדום והפונקציות של מבנים ביולוגיים רבים22. לכן סביר לצפות כי החלפות אנלוגי פרולין Pro→ להעניק טבעת B, הטבעת השנייה של nisin, עם הרומן ומאפיינים יוצא דופן.
כאן, של פרולין-auxotrophic e. coli זן שימש לייצור nisin רקומביננטי. פעולה זו דורשת את הביטוי של ג’ין prepeptide nisA , כמו גם את השינוי גנים של האנזים nisBC. המוצר פפטיד מקודדים גנטית נושא N-סופני שלו מתויג מנהיג עבור טיהור באמצעות כרומטוגרפיית זיקה. עבור פעילות נחישות, ל’ lactis להביע והוא מפריש NisPT משמשת להפעלת על גרסאות רקומביננטי nisin lysates תא החיידק או דגימות פפטיד מטוהרים (איור 1). מגבר בוגר הוא שוחרר לאחר המחשוף של המנהיג על ידי NisP. בשיטה זו דיפוזיה אגר, המדגם המגבר מפזרת לתוך מדיום הגידול מוצק, יכול לעכב את הצמיחה של בקטריה גראם חיוביים. לאחר דגירה, זה יכול להיות שנצפו ויזואלית על ידי הצמיחה עיכוב הילות. בנוסף ל’ lactis כמחוון, שינוי גרסאות nisin הראו פעילות מיקרוביאלית נגד Enterococcus faecalis, Bacillus קובו, Staphylococcus aureus, לקטובצילוס johnsonii 21,23.
שיטה אלטרנטיבית ושונה השפעול לשלב ncAAs ב RiPPs הוא stop codon דיכוי (SCS)24. בשביל זה, tRNA אורתוגונלית / aminoacyl-סינתזת המעביר (aaRS) זוג נדרש עבור ncAA המתאימים. באופן אידיאלי, כל שלושת הרכיבים האלה הם bioorthogonal, קרי, הם לא לקיים אינטראקציה עם tRNAs ו aaRSs אנדוגני. AaRS ncAA ספציפי יכול להיווצר על ידי שינוי של האתר הפעיל של אנזים והקרנת ספריות גנטי של מוטציה synthetases25. יתר על כן, המבוא של ncAA מחייב של codon אשר מוקצית, אשר לא קידוד עבור המנהל האזרחי. בדרך כלל, אמבר stop codon נמצא בשימוש24,26.
לאחרונה, SPI הוקמה עבור שילוב של α-chloroacetamide-המכילים ‘, לחץ על-כימיה-תואם ncAAs לתוך NisA27. לדוגמה, Nε– היתרים-ליזין סופחה את captistruin פפטיד לאסו בייעודי לאתר (SCS), שאריות ספציפיים (SPI) התאגדות שיטות, לאחר מכן שונה חוץ גופית בתוך מאת שיכול עיצורים מזורז רותניום28 . בהשוואה ל- SPI השיטה SCS מורכבת יותר מאז tRNA אורתוגונלית / זוג aaRS חייב להיות ביטוי במשותף. עד כה, o-זוגות על התאגדות פרולין היה מפותח29, אך לפי מיטב ידיעתנו, דווח אף דוגמא התאגדות אנלוגי פרולין.
יצוין, כי לא כל ncAAs ניתן לשלב באמצעות המתודולוגיה SPI. קודם כל, ספיגת ncAAs לתוך הציטופלסמה מוסדר על ידי מספר רב של חלבונים תחבורה מוטבעות ממברנה cytoplasmic, המהווה הקרום הפנימי עבור חיידקים גראם שליליים כמו e. coli. בדרך כלל, e. coli הוא המסוגל להעביר מגוון רחב של תחליפי חומצת אמינו לתוך התא עם שרשראות צד מבנית דומה מבחינה כימית הקנוני חומצות אמינו. שנית, רבים ncAAs תגובתי מבחינה כימית או לא יציב יכול לשמש מעכב לקראת צמיחה סלולרי, כפי שהם רעילים כי חילוף החומרים, פיזיולוגיה של המחשב המארח תא30. לפיכך, ספיגת ורעילות של ncAA עבור המארח הייצור צריך להיבדק מראש. כדי להימנע איון של מכונות PTM כתופעת לוואי, מלכודת מבוקר בקפדנות ביטוי של גנים אחראים יכול לשמש כדי לשלב את חומצת אמינו טבעי אנזימים השינוי (למשל, nisBC) ו- ncAA לתוך הגן היעד ( למשל, nisA). זה יכול להתבצע באמצעות שני היזמים שונים, אינדוקציה של ביטוי גנים היעד, כפי שמתואר ב SPI שתוכנן במיוחד פרוטוקולים31. כמתואר לעיל, שיטת SPI מסתמך על יחודיות המצע רגועה של aaRS, אשר מאפשר הפעלת המכללות tRNA cognate טעינה. לאחר מכן, סינתזת יועברו אל הריבוזום ואחריו אמיד בונד היווצרות וקיפול של פפטיד היעד (פולי). בתהליכי הזה, הגהה ועריכה מנגנונים עלולים להיות רלוונטי32. מסיבות אלו, יש חשיבות גדולה יש מטרה המכללות דומה מבחינה מבנית רחמנא ליצלן המנהל האזרחי. נקודות חיוניים אחרים הן יציבות מספקת (שניהם בתקשורת צמיחה, חשוף חילוף החומרים הסלולר), המסיסות של ncAA. בנוסף, זה צריך להיות או זמינים מסחרית או קל להיות מסונתז כימית.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור SPI, ומאפשר תיאגוד ספציפיים שאריות ncAAs לתוך RiPPs רקומביננטי. במיוחד, פרולין שונים תחליפי משולבים של פפטיד מיקרוביאלית nisin A באמצעות e. coli כמו האורגניזם המארח. ספקטרומטר מסה משמש לאימות החלפת חומצת אמינו, מוצרים פפטיד מנותחים על אתריים באמצעות מבחני עיכוב גדילה ומיקרוסקופיה פלורסצנטיות באמצעות זני חיידקים אינדיקטור.
הדרישה הבסיסית nisin רקומביננטי מוצלחת הביטוי מוגדר ncAAs דורשת פרולין מתאימים auxotrophic e. coli זן. על זה auxotrophy, proA חייב להיות לקוי, למשל מושגת על ידי הסתרה גנומית. התאים לגמרי משולל ביוסינטזה Pro תאיים (קרי, מחיקה של proABC) ללא אפשרות השחזור הם auxotrophs יציב. שיטות נוקאאוט גנטי נפוץ הן phage התמרה חושית או נוקאאוט יחיד-גנטי לפי דצנקו & Wanner33. יתר על כן, ניתן להשיג proA נוקאאוט זנים מאגרים ציבוריים כגון Addgene, CGSC או האוסף קאיו. מאז הביטוי רקומביננטי nisABC המוצגת כאן מסתמך על השימוש T7 היזמים, המתח מארח ביטוי יש לשאת את הגן inducible T7 RNA פולימראז. זה יכול להתבצע על ידי החדרת prophage λDE3 לתוך הגנום המארח, לדוגמה באמצעות ערכת מסחרי. לחלופין, זנים כמו BL21(DE3) יכול להתבצע auxotrophic כמתואר לעיל.
Protocol
Representative Results
Discussion
באמצעות SPI להכנסה של תחליפי פרולין, המבנים nisin יישוב יכול להיות משמעותי שונה, יצירת גרסאות הרומן פפטיד עם שילובים רצף ייחודי ומאפיינים כימי. בדרך זו, גבול בסיסי בטכנולוגיה גנטית קלאסית יכול שיפרו, אשר הוא מוגבל ל הצד שרשרת בדיקות, הביוכימיה של cAAs 20. In vivo גיוון הכימית של nisin כפי שהודגם לעיל ממחיש הגישה המשלימה PTMs טבעי וכדי לשפר באופן דרמטי את שטח הכימית של RiPPs. אנו מאמינים כי הרחבת הרפרטואר חומצות אמינו טבעיות מחזיקה הבטחה גדולה במיוחד עבור מגברים. בחלבונים, מגוון עצום של פונקציות יכול להתממש באמצעות סידור מוגדר של cAAs 20 מבנים תלת מימדיים. עם רק 7-100 aa אורך3, דרכים להשיג תכונות מבניות כגון רק דרך cAAs יהיה מוגבל עבור מגברים. זה ולכן לא מפתיע כי מגברים טבעי בצורה של RiPPs הם בדרך כלל ששונה בהרחבה post-translationally4. באותו אופן, ncAAs כאבני בנייה אלטרנטיבית החזק הבטחה גדולה כדי לשפר את הפרמטרים שלהם pharmacodynamic, פרמקוקינטיקה ופרמקודינמיקה (ראה באומן. ואח 201735 והפניות בו).
המתודולוגיה SPI המשמשים את יתרונות עבודה הגדרת הניסוי קל יחסית, ביצוע פעולה פשוטה, הפארמצבטית גבוהה. עקב החלפת גלובלית, ncAA ריבוי האתרים, שהשתלבה פפטידים המטרה היא גם אפשרית. מצד שני, השיטה לא ייתכן נאותה להחלפה של חומצות אמינו המתרחשים לעתים קרובות המוצר ג’ין היעד. באופן עקרוני, ניתן לשינוי עמדות בלתי רצויה על ידי מוטגנזה, אך שינויים נוספים אלה עשויים גם להשפיע על מספר מאפיינים המגבר כולל מבנה אתריים. ברגע זן auxotrophic לייצור זמין, ניתן לבחון את ncAAs מספר מבלי לדרוש שינויים נרחבים ברמה הגנטית. יתר על כן, השיטה אינה מוגבלת auxotrophic e. coli זנים, אך ניתן גם לבצע באמצעות המחשב המארח הייצור הטבעי. לדוגמה, ג’ואו. et al. הראה SPI לייצור של הרומן RiPPs פועל גם ב- באופן טבעי Trp-auxotroph ל’ lactis: שימוש מוגדר מדיה, שלוש תחליפי טריפטופן שולבו בשעה ארבע עמדות nisin50.
מאז השיטה SPI מוביל להחלפת הכללית של הנבחרת סי על ידי ncAA, זה חלים באופן כללי על מגוון רחב של היעד פפטידים וחלבונים. מגוון של auxotrophic e. coli זנים זמין (ראה שלב 1), המאפשר מספר cAAs כל להיבדק להחלפה ע י ncAAs. פגשתי תחליפי שולבו באמצעות מטא-זנים לקוי (למשל, B834(DE3)) הם בדרך כלל מועסקים. דוגמאות isostructural Met מקבילים הן azidohomoalanine (Aha) ו homopropargylglycine (Hpg), ncAAs זמינים מסחרית אשר ניתן לשלב ביעילות. שניהם מציגים ידיות bioorthogonal אשר מאפשרים מצורף של מולקולות נושאת של אלקין תואם או פונקציונליות אזיד, בהתאמה. לדוגמה, צבעי פלורסנט או moieties פוליאתילן גליקול (PEG) יכול להיות מצורף על ידי נחושת (I)-מזורז אזיד אלקין cycloaddition (CuAAC)51.
למרות שתי השיטות התאגדות רקומביננטי ncAA (SPI ו- SCS) בדרך כלל להשיג יעד בכמות מספקת, התשואות מופחתים לעיתים קרובות יחסית ייצור פראי-סוג של פפטידים המתאימים, חלבונים. כפי purities תדירות לתאם עם יעילות הייצור, שלבי טיהור נוסף יהיה צורך, במיוחד עבור מינים נמוך-בשפע. במקרה ספציפי זה של ייצור nisin רקומביננטי, הרצף מנהיג שלו מתויג מאוד מפשט טיהור RiPP על ידי העשרת סלקטיבי של lysates התא. הטיהור שמוצג פרוטוקול זה משפר את הטוהר ואת ריכוז של nisin, אבל לעתים קרובות אינה נותנת כח purities מספיק כדי להחליט מה ביבול ובאיכות פעילות ספציפית. מלבד IMAC, שיטות לטיהור המגבר נפוצים כוללים HPLC, יונים כרומטוגרפיה (חברת החשמל), משקעים (למשל. באמצעות אצטון או חומצת חומץ טריכלור (TCA)) או צירופם – והתוצאה היא ערכה רב שלבי טיהור52 . יצוין כי שלהם בדרך כלל polycationic הטבע יכול להקל על חברת החשמל טיהור. ליופיליזציה משמש לעתים קרובות כדי לאחסן אמפר מטוהרים.
באופן אידיאלי, ncAAs על השתלבות אמפר הנמכרים במחירים סבירים או בקלות המיוצר על ידי סינתזה לשחזור ופשוט פרוטוקולים. תנאי מוקדם חשוב לא פחות עבור שיטת SPI הוא ncAA היא מזוהה, מופעל גובים על גבי tRNA cognate aaRS אנדוגני או ביטוי במשותף. זה יכול להיות נבדק במבחנה על ידי חומצת אמינו הפעלה או tRNA aminoacylation assay53. כחלופה נוחה, SPI ביטויים מבחן של מודל חלבונים כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) שנערך שניהם בנוכחות, בהעדר ncAA תוספי יכול להתבצע. יתר על כן, המסיסות צמיחה בינוני ותא פרמאביליות, כמו גם לשחיקה מהווים גורמים חשובים.
בדוגמה זו, פעילות מיקרוביאלית הוקרן באמצעות זן מחוון גראם חיוביים. זה מבטא את מנהיג peptidase NisP, השלב הסופי של התבגרות nisin מזורז. הסרה של הרצף מנהיג (שלו מתויג למטרות טיהור) יכול להיות גם בביצוע במבחנה על ידי טיפול עם מטוהרים NisP50 או טריפסין54. מעבר להיקף של עבודה זו, אורגניזמים פתוגניים וללחצים multidrug עמידים ואז ניתן לבחון עיכוב bacteriostatic או אחרים על-ידי אמפר באמצעות מתודולוגיה דומה. היעד הרלוונטית קלינית מינים כוללים MRSA, MDR שחפת Mycobacterium, VRE, Acinetobacter baumannii, סטרפטוקוקוס pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa , קלבסיאלה pneumoniae. מלבד פעפוע צלחת אגר assay המובאים כאן, הצמיחה עיכוב יכול גם להתבצע באמצעות המדיה המתאימה נוזלי מחוסן עם המין חיידקי, בתוספת כח. באמצעות שיטות לדילול ציר, הריכוז המעכב מינימלי (MIC) ניתן לקבוע באמצעות פפטידים טהור55. וזמינותו הפעילות המוצגת כאן יכול לשמש גם כדי להעריך את bioactivity ואת עוצמת מגבר המכיל פתרונות ביחס הפניה תרכובות, nisin לדוגמה זמינים מסחרית.
ייצור רקומביננטי RiPPs לעתים קרובות ריאלי39, אשר בדרך כלל כולל שיתוף ביטוי של גנים PTM. ברגע המתח הייצור הועבר לתוך מדיום מינימלי מוגדר באופן כימי או סינתטי המכיל של ncAA מתאימים, שאריות ספציפיים החלפה של המנהל האזרחי המתאימים מתקיים. לפיכך, RiPPs אחרים יכול להיות מיוצר על ידי המתודולוגיה זהה, ובלבד ייצורם רקומביננטי הוא ריאלי, תנאים ניתן למצוא איפה התאגדות המכללות, PTM תשואות כמויות מספיקות של המוצר היעד. שימו לב כי מלבד פרוטאום התא המארח, המכונות PTM פפטיד יכולים להפוך גם המכללות-השתנה במהלך SPI. כתוצאה מכך, העיתוי של היעד ביטוי אינדוקציה ואורך תקופת הדגירה הבאים תוכל לדרוש אופטימיזציה. מאז ncAA שהשתלבה אנזימים PTM יכול להשפיע על היציבות שלהם, פעילות, ייצור RiPP מעובד באופן עקרוני יושפעו. מספיק PTM אנזים היעילות שציין היווצרות של prepeptide מעובד, כפי שזוהו על-ידי מבחני MS ו- bioactivity. כפי שהובאו לעיל, היזמים inducible שונים יכול להיות מועסק על מנת לייצר את PTM גנים קודם (בהעדר ncAA) ואחריו אינדוקציה של הגן פפטיד קודמן בנוכחות של ncAA. באופן כללי, חייבים לדכא הייצור של המכילות סי פפטיד היעד לפני תוספת של ncAA, ולכן דיכוי חזק של הגן קודמן נדרש. בתוך פרוטוקול זה, זו מושגת על ידי דיכוי קטבולי באמצעות התוספת של גלוקוז למדיום הגידול. במיוחד מאז PTM אנזימים הדרושים לעיבוד prepeptide מקורן בדרך כלל מחשב מארח מרוחק מבחינה גנטית, השימוש טמפרטורה, codon הביטוי של הגנים המתאימים תוכל לדרוש אופטימיזציה אם הייצור רקומביננטי טרם בוטלה הקים. בעקרון, הנוכחות של ncAAs, prepeptide יכול להתערב עם זיהוי ועיבוד של אנזימים PTM, במקרה של nisin NisBC ו- NisP. עבור ליגת המכללות שהשתלבה אמפר, ובכך מומלץ לבצע ניסויים בקנה מידה קטן ביטוי תחילה כדי לזהות ביטוי מתאים לתנאים והאמינות של המגבר פעילות וזמינותו.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.H.N., שחפת, מ ב לאשר מימון על-ידי התוכנית האיחוד האירופי FW7 (SYNPEPTIDE). י. פ-ס ו טי להכיר במימון משרד החינוך הפדרלי, מדע (BMBF תוכנית “HSP 2020”, TU-WIMIplus פרוייקט SynTUBio) ושל קרן מחקר גרמני (אשכול של מצוינות “Unifying מושגים זרז”).
Materials
| sodium chloride | Carl Roth, Germany | P029 | |
| guanidine hydrochloride | Carl Roth, Germany | 0035.2 | |
| dipotassium hydrogen phosphate | Carl Roth, Germany | P749.3 | |
| potassium dihydrogen phosphate | Carl Roth, Germany | 3904.3 | |
| sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Carl Roth, Germany | K300.2 | |
| disodium hydrogen phosphate | Carl Roth, Germany | P030.2 | |
| L-alanine | Carl Roth, Germany | 3076.2 | |
| L-arginine | Carl Roth, Germany | 3144.3 | |
| L-asparagine monohydrate | Carl Roth, Germany | HN23.1 | |
| L-aspartic acid | Carl Roth, Germany | T202.1 | |
| L-cysteine | Carl Roth, Germany | 3467.3 | |
| L-glutamine | Carl Roth, Germany | 3772.1 | |
| L-glutamic acid | Carl Roth, Germany | 3774.1 | |
| L-glycine | Carl Roth, Germany | 3187.3 | |
| L-histidine | Carl Roth, Germany | 3852.3 | |
| L-isoleucine | Carl Roth, Germany | 3922.3 | |
| L-leucine | Carl Roth, Germany | 3984.3 | |
| L-lysine monohydrate | Carl Roth, Germany | 4207.2 | |
| L-methionine | Carl Roth, Germany | 9359.4 | |
| L-phenylalanine | Carl Roth, Germany | 4491.2 | |
| L-proline | Carl Roth, Germany | T205.3 | |
| L-serine | Carl Roth, Germany | 4682.4 | |
| L-threonine | Carl Roth, Germany | T206.2 | |
| L-tryptophan | Carl Roth, Germany | 4858.2 | |
| L-tyrosine | Carl Roth, Germany | T207.2 | |
| L-valine | Carl Roth, Germany | 4879.4 | |
| ammonium sulfate | Carl Roth, Germany | 3746.3 | |
| magnesium sulfate | Carl Roth, Germany | 0261.2 | |
| D-glucose | Carl Roth, Germany | 6780 | prepare a 20% (w/v) solution for addition into molten agar |
| calcium chloride | Carl Roth, Germany | PN93.2 | |
| iron(II) chloride | Sigma-Aldrich, Germany | 372870 | |
| thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Germany | T1270 | |
| biotin | Carl Roth, Germany | 3822.2 | |
| copper(II) sulfate | Merck, Germany | 102792 | |
| manganese(II) chloride | Carl Roth, Germany | KK36.2 | |
| zinc chloride | Merck, Germany | 108816 | |
| immonium orthomolybdate | Sigma-Aldrich, Germany | 277908 | |
| glycerol | Carl Roth, Germany | 7533.3 | |
| isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich, Germany | I6758 | |
| ampicillin sodium salt | Carl Roth, Germany | K029.5 | working concentration 100 µg/mL for E. coli, prepare 100 mg/mL stock in ddH2O |
| kanamycin sulfate | Carl Roth, Germany | T832.2 | working concentration 50 µg/mL for E. coli, prepare 50 mg/mL stock in ddH2O |
| chloramphenicol | Carl Roth, Germany | 3886.1 | working concentration 5 µg/mL for L. lactis, prepare 37 mg/mL stock in ethanol |
| (4S)-fluoroproline | Bachem, Switzerland | F-3970 | |
| (4R)-fluoroproline | Bachem, Switzerland | F-3975 | |
| (4S)-hydroxyproline | Bachem, Switzerland | F-1395 | |
| (4R)-hydroxyproline | Bachem, Switzerland | F-2980 | |
| (4S)-methanoproline | chemically synthesized | ||
| (4R)-methanoproline | chemically synthesized | ||
| hydrochloric acid (HCl) | Carl Roth, Germany | P074.4 | |
| ethanol | VWR, Germany | 20825.324 | |
| M17-broth | Sigmal-Aldrich, Germany | 56156 | commercial product, see Terzaghi BE & Sandine WE, Appl Microbiol., 1975, 29(6):807-13 for contents and preparation |
| agar-agar | Carl Roth, Germany | 5210.5 | |
| Nisin from Lactococcus lactis | Sigma-Aldrich, Germany | N5764 | commercial product, can be used as reference for bioactivity |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Carl Roth, Germany | A994.1 | |
| imidazole | Carl Roth, Germany | 3899.3 | |
| 1.5 mL autosampler vial for LC-MS | Sigma-Aldrich, Germany | Supelco 854165 | |
| acetonitrile | VWR, Germany | HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642 | LC-MS grade required |
| formic acid | VWR, Germany | HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865 | LC-MS grade required |
| 1 mL Ni-NTA IMAC column, e.g. HisTrap FF Crude | GE Healthcare, UK | 29-0486-31 | different manufacturers and resins available for IMAC |
| 0.45 µm bottle top filter unit | VWR, Germany | 10040-470 | sterile filtration of solutions using a vacuum pump |
| 0.45 µm syringe filter PVDF membrane | Carl Roth, Germany | CCY1.1 | sterile filtration of solutions using a syringe and to remove particles from cell lysates |
| luer-lock syringe, PP, 50 ml | Carl Roth, Germany | T552.2 | sterile filtration of solutions |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf, Germany | 30120086 | |
| petri dishes (polystyrene, sterile) | Carl Roth, Germany | TA19 | |
| Nile red | Sigma-Aldrich, Germany | 72485 | |
| E. coli ΔproA strain | CGSC, Keio collection | JW0233-2 | proline-auxotrophic E. coli K-12 strain |
| E. coli B834(DE3) | Novagen (Merck), Germany | 69041 | methionine-auxotrophic E. coli B strain |
| λDE3 Lysogenization Kit | Novagen (Merck), Germany | 69734-3 | |
| Lactococcus lactis NZ9000 pNG nisPT | bacterial indicator strain, see Khusainov R & Kuipers OP, PLoS One, 8 (9), e74890 | ||
| benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf, Germany | 5427 R | |
| peristaltic pump | GE Healthcare, UK | P1 | |
| FPLC system | GE Healthcare, UK | Äkta Purifier 10 or the like | |
| inverted microscope | Nikon | TI Eclipse wide-field fluorescence microscope with 100x (N.A. 1.4) objective and Mercury Lamp | example setup for fluorescence microscopy |
| electron multiplying CCD (EMCCD) camera | Andor Technologies, UK | Andor Luca | example setup for fluorescence microscopy |
| fluorescence excitation filter | Thorlabs, USA | Dichroic cube (TLV-U-MF2-TRITC) | example setup for fluorescence microscopy |
| fluorescence emission filter | AHF Analysentechnik, Germany | T 560 LPXR | example setup for fluorescence microscopy |
| cover slip 24 x 60 mm | Carl Roth, Germany | LH26.1 | example setup for fluorescence microscopy |
| Immersion Oil | Carl Zeiss, Germany | Immersol 518 F | example setup for fluorescence microscopy |
| probe sonicator | Bandelin, Germany | Sonopuls HD3200 with sonotrode MS-72 | 200 W maximum HF output |
| C5 HPLC column (2.1×100 mm, 3 µm particle size) | Sigma-Aldrich, Germany | 567227-U | example setup for mass spectrometry |
| ESI-TOF coupled to HPLC system | Agilent, USA | Agilent 6530 Accurate Mass QTOF with 1260 HPLC | example setup for mass spectrometry |
References
- Ferri, M., Ranucci, E., Romagnoli, P., Giaccone, V. Antimicrobial resistance: A global emerging threat to public health systems. Crit Rev Food Sci Nutr. 57 (13), 2857-2876 (2017).
- Bahar, A. A., Ren, D. Antimicrobial peptides. Pharmaceuticals. 6 (12), 1543-1575 (2013).
- Ageitos, J. M., Sánchez-Pérez, A., Calo-Mata, P., Villa, T. G. Antimicrobial peptides (AMPs): Ancient compounds that represent novel weapons in the fight against bacteria. Biochem Pharmacol. 133, 117-138 (2017).
- Arnison, P. G., et al. Ribosomally synthesized and post-translationally modified peptide natural products: overview and recommendations for a universal nomenclature. Nat Prod Rep. 30 (1), 108-160 (2013).
- Lubelski, J., Rink, R., Khusainov, R., Moll, G. N., Kuipers, O. P. Biosynthesis, immunity, regulation, mode of action and engineering of the model lantibiotic nisin. Cell Mol Life Sci. 65 (3), 455-476 (2008).
- Shin, J. M., Gwak, J. W., Kamarajan, P., Fenno, J. C., Rickard, A. H., Kapila, Y. L. Biomedical applications of nisin. J Appl Microbiol. 120 (6), 1449-1465 (2016).
- Scherer, K. M., Spille, J. -. H., Sahl, H. -. G., Grein, F., Kubitscheck, U. The lantibiotic nisin induces lipid II aggregation, causing membrane instability and vesicle budding. Biophys J. 108 (5), 1114-1124 (2015).
- Jung, G. Lantibiotica – ribosomal synthetisierte Polypeptidwirkstoffe mit Sulfidbrücken und α,β-Didehydroaminosäuren. Angew Chemie. 103 (9), 1067-1084 (1991).
- Rink, R., et al. Lantibiotic structures as guidelines for the design of peptides that can be modified by lantibiotic enzymes. Biochemistry. 44 (24), 8873-8882 (2005).
- Lagedroste, M., Smits, S. H. J., Schmitt, L. Substrate Specificity of the Secreted Nisin Leader Peptidase NisP. Biochemistry. 56 (30), 4005-4014 (2017).
- Ross, A. C., Liu, H., Pattabiraman, V. R., Vederas, J. C. Synthesis of the lantibiotic lactocin S using peptide cyclizations on solid phase. J Am Chem Soc. 132 (2), 462-463 (2010).
- Fukase, K., et al. Synthetic Study on Peptide Antibiotic Nisin. V. Total Synthesis of Nisin. Bull Chem Soc Jpn. 65 (8), 2227-2240 (1992).
- Dumas, A., Lercher, L., Spicer, C. D., Davis, B. G. Designing logical codon reassignment – Expanding the chemistry in biology. Chem Sci. 6 (1), 50-69 (2015).
- Kuthning, A., Durkin, P., Oehm, S., Hoesl, M. G., Budisa, N., Süssmuth, R. D. Towards Biocontained Cell Factories: An Evolutionarily Adapted Escherichia coli Strain Produces a New-to-nature Bioactive Lantibiotic Containing Thienopyrrole-Alanine. Sci Rep. 6, 33447 (2016).
- Piscotta, F. J., Tharp, J. M., Liu, W. R., Link, A. J. Expanding the chemical diversity of lasso peptide MccJ25 with genetically encoded noncanonical amino acids. Chem Commun (Camb). 51 (2), 409-412 (2015).
- Hartman, M. C. T., Josephson, K., Lin, C. -. W., Szostak, J. W. An expanded set of amino acid analogs for the ribosomal translation of unnatural peptides. PLoS One. 2 (10), 972 (2007).
- Johnson, J. A., Lu, Y. Y., Van Deventer, J. A., Tirrell, D. A. Residue-specific incorporation of non-canonical amino acids into proteins: recent developments and applications. Curr Opin Chem Biol. 14 (6), 774-780 (2010).
- Ibba, M., Söll, D. Aminoacyl-tRNAs: setting the limits of the genetic code. Genes Dev. 18 (7), 731-738 (2004).
- Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
- Budisa, N., Steipe, B., Demange, P., Eckerskorn, C., Kellermann, J., Huber, R. High-level biosynthetic substitution of methionine in proteins by its analogs 2-aminohexanoic acid, selenomethionine, telluromethionine and ethionine in Escherichia coli. Eur J Biochem. 230 (2), 788-796 (1995).
- Rink, R., et al. Dissection and modulation of the four distinct activities of nisin by mutagenesis of rings A and B and by C-terminal truncation. Appl Environ Microbiol. 73 (18), 5809-5816 (2007).
- Kubyshkin, V., Durkin, P., Budisa, N. Energetic contribution to both acidity and conformational stability in peptide models. New J Chem. 40 (6), 5209-5220 (2016).
- Molloy, E. M., Field, D., O’Connor, P. M., Cotter, P. D., Hill, C., Ross, R. P. Saturation mutagenesis of lysine 12 leads to the identification of derivatives of nisin A with enhanced antimicrobial activity. PLoS One. 8 (3), 58530 (2013).
- Wang, L., Brock, A., Herberich, B., Schultz, P. G. Expanding the genetic code of Escherichia coli. Science. 292 (5516), 498-500 (2001).
- Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
- Anderson, J. C., Wu, N., Santoro, S. W., Lakshman, V., King, D. S., Schultz, P. G. An expanded genetic code with a functional quadruplet codon. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (20), 7566-7571 (2004).
- Zambaldo, C., Luo, X., Mehta, A. P., Schultz, P. G. Recombinant macrocyclic lanthipeptides incorporating non-canonical amino acids. J Am Chem Soc. 139 (34), 11646-11649 (2017).
- Al Toma, R. S., et al. Site-directed and global incorporation of orthogonal and isostructural noncanonical amino acids into the ribosomal lasso peptide capistruin. Chembiochem. 16 (3), 503-509 (2015).
- Chatterjee, A., Xiao, H., Schultz, P. G. Evolution of multiple, mutually orthogonal prolyl-tRNA synthetase/tRNA pairs for unnatural amino acid mutagenesis in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (37), 14841-14846 (2012).
- Budisa, N., Pal, P. P. Designing novel spectral classes of proteins with a tryptophan-expanded genetic code. Biol Chem. 385 (10), 893-904 (2004).
- Voller, J. -. s., Thi To, T. M., Biava, H., Koksch, B., Budisa, N. Global substitution of hemeproteins with noncanonical amino acids in Escherichia coli with intact cofactor maturation machinery. Enzyme Microb Technol. 106, 55-59 (2017).
- Moghal, A., Hwang, L., Faull, K., Ibba, M. Multiple Quality Control Pathways Limit Non-protein Amino Acid Use by Yeast Cytoplasmic Phenylalanyl-tRNA Synthetase. J Biol Chem. 291 (30), 15796-15805 (2016).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Engelke, G., Gutowski-Eckel, Z., Hammelmann, M., Entian, K. D. Biosynthesis of the lantibiotic nisin: genomic organization and membrane localization of the NisB protein. Appl Environ Microbiol. 58 (11), 3730-3743 (1992).
- Baumann, T., Nickling, J. H., Bartholomae, M., Buivydas, A., Kuipers, O. P., Budisa, N. Prospects of In vivo Incorporation of Non-canonical Amino Acids for the Chemical Diversification of Antimicrobial Peptides. Front Microbiol. 8, 124 (2017).
- Plat, A., Kluskens, L. D., Kuipers, A., Rink, R., Moll, G. N. Requirements of the engineered leader peptide of nisin for inducing modification, export, and cleavage. Appl Environ Microbiol. 77 (2), 604-611 (2011).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. J Vis Exp. , (2017).
- Shi, Y., Yang, X., Garg, N., van der Donk, W. A. Production of lantipeptides in Escherichia coli. J Am Chem Soc. 133 (8), 2338-2341 (2011).
- Hochuli, E., Bannwarth, W., Döbeli, H., Gentz, R., Stüber, D. Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent. Nat Biotechnol. 6 (11), 1321-1325 (1988).
- Zhang, Z., Marshall, A. G. A universal algorithm for fast and automated charge state deconvolution of electrospray mass-to-charge ratio spectra. J Am Soc Mass Spectrom. 9 (3), 225-233 (1998).
- JoVE Science Education Database. High-Performance Liquid Chromatography (HPLC). J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Dialysis: Diffusion Based Separation. J Vis Exp. , (2017).
- Khusainov, R., Kuipers, O. P. The presence of modifiable residues in the core peptide part of precursor nisin is not crucial for precursor nisin interactions with NisB- and NisC. PLoS One. 8 (9), 74890 (2013).
- Terzaghi, B. E., Sandine, W. E. Improved medium for lactic streptococci and their bacteriophages. Appl Microbiol. 29 (6), 807-813 (1975).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 82 (7-8), 518-529 (2015).
- . Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).
- van Hest, J. C. M., Tirrell, D. A. Efficient introduction of alkene functionality into proteins in vivo. Febs Lett. 428 (1-2), 68-70 (1998).
- Prince, A., et al. Lipid-II Independent Antimicrobial Mechanism of Nisin Depends On Its Crowding And Degree Of Oligomerization. Sci Rep. 6 (1), 37908 (2016).
- Zhou, L., et al. Incorporation of tryptophan analogues into the lantibiotic nisin. Amino Acids. 48 (5), 1309-1318 (2016).
- Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. G. Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation. Curr Protoc Chem Biol. 3 (4), 153-162 (2011).
- Abts, A., et al. Easy and rapid purification of highly active nisin. Int J Pept. 2011, 175145 (2011).
- Francklyn, C. S., First, E. A., Perona, J. J., Hou, Y. -. M. Methods for kinetic and thermodynamic analysis of aminoacyl-tRNA synthetases. Methods. 44 (2), 100-118 (2008).
- van Heel, A. J., et al. Production and Modification of Five Novel Lantibiotics Using the Promiscuous Nisin Modification Machinery. ACS Synth Biol. 5 (10), 1146-1154 (2016).
- Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. W. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat Protoc. 3 (2), 163-175 (2008).
