مضادات الميكروبات الببتيدات ينتجها إدماج الضغط الانتقائي من الأحماض الأمينية غير متعارف عليه
Summary
ويقدم البروتوكول الإشريكيّة القولونية-على أساس إدماج الضغط الانتقائي من الأحماض الأمينية غير المقبول (ncAAs) في نيسين الببتيد الميكروبات لاكتوكوككال. يمكن تغيير الخصائص الخاصة به أثناء المؤتلف التعبير عن طريق استبدال مع ncAAs المطلوب في وسائط النمو المحددة. يتم تعيين التغييرات الناجمة عن ذلك في بيواكتيفيتي فحوصات تثبيط النمو والفحص المجهري الأسفار.
Abstract
الطبيعة لديها مجموعة متنوعة من الإمكانيات لإنشاء مهام جديدة من البروتين عن طريق تعديل التسلسل لبنات بناء الأحماض الأمينية الفردية. ومع ذلك، تستند كافة التباينات 20 الأحماض الأمينية الكنسي (الهيئة). كوسيلة لإدخال إضافية الخصائص الفيزيائية الكيميائية البروتينية، يزداد يستخدم دمج الأحماض الأمينية غير المقبول (ncAAs) في هندسة البروتينات. نظراً لمدة قصيرة نسبيا، تعديل الببتيدات تجميعي مشفر وتعديل بوستترانسلاتيونالي من ncAAs جاذبية خاصة. يمكن إنشاء وظائف جديدة ومقابض الكيميائية بتعديلات محددة من بقايا الفردية. تستخدم طريقة إدماج (SPI) الضغط الانتقائي سلالات المضيف أوكسوتروفيك أن يحرم من الأحماض الأمينية الأساسية في وسائط النمو محددة كيميائيا. يمكن ثم يمكن تنشيطه بواسطة سينثاتيز aminoacyl-الحمض الريبي النووي النقال المقابلة عدة النظير من الأحماض الأمينية متشابهة كيميائيا وهيكليا وتوفير cAA(s) الخاصة بالمخلفات ← ncAA(s) استبدالات في تسلسل الببتيد أو البروتين الهدف. على الرغم من ذلك، في سياق الأسلوب SPI، أدرجت أيضا ncAAs في البروتين المضيف أثناء مرحلة التعبير الجيني المؤتلف، يتم تعيين معظم الموارد للخلية للتعبير عن الجين المستهدف. وهذا يتيح إدراج خاصة ببقايا كفاءة ncAAs غالباً ما يترافق مع كميات كبيرة من المعدل المستهدف. يصف العمل الذي قدم في فيفو إدراج ستة برولين النظير في نيسين الببتيد مضادات الميكروبات، لانتيبيوتيك طبيعة الحال التي تنتجها لاكتيس لاكتوكوككوس. يمكن تغيير خصائص مضادات الميكروبات نيسين وتوسيع أثناء التخمير والتعبير في أوكسوتروفيك الإشريكيّة القولونية سلالات في وسائط النمو المحددة. وبالتالي، يمكن تسليم آثار الاستبدال الخاصة بالمخلفات من الهيئة مع ncAAs التغيرات في نشاط مضادات الميكروبات وخصوصية. فحوصات نشاط مضادات الميكروبات والأسفار الفحص المجهري تستخدم لاختبار المتغيرات نيسين الجديدة لتثبيط النمو من سلالة مؤشرات إيجابية لاكتيس لاكتوكوككوس . يتم استخدام التحليل الطيفي الشامل للتأكد من إدماج نكا في المتغيرات نيسين النشطة بيولوجيا.
Introduction
اكتشاف المضادات الحيوية في القرن الحادي والعشرين، والتطور الموازي لمركبات مضادات جديدة ضد الأحياء المجهرية الممرضة تمكين تستهدف علاج العدوى البكتيرية. ومع ذلك، نظراً لظهور مسببات المقاوم للأدوية المتعددة مثل مقاومة للميثيسيلين ستافيلوكوككوسوريوس (الجرثومة)، المكوّرات مقاومة للفانكوميسين (فري)، اكتب بالعاثية المقاوم للأدوية المتعددة (المقاوم للأدوية المتعددة) typhimurium السالمونيلا 10 (DT10 )، الكلبسيله الرئوية، من الضروري على وجه الاستعجال لتوليد مضادات الجراثيم الجديدة1. مضادات الميكروبات الببتيدات (الامبير) هي مركبات تنوعاً، ومحددة للغاية وكثيراً ما أن المرشحين الواعدين لتطوير أدوية جديدة بفضل الخصائص الفيزيائية، والمرونة، وحجمها وهيدروفوبيسيتي، ووضع الإجراء2. هي الامبير الببتيدات الصغيرة عادة ما تتألف من الأحماض الأمينية 7-100. وكثيراً ما لديهم بنية الموجبة غنية ببقايا ارجينين ويسين مشحونة بشكل إيجابي، التي تتفاعل مع غشاء الخلية الميكروبية المستهدفة، التي يتوجب معاكس3. هي مجموعة فرعية معينة من الامبير الببتيدات تجميعي مشفر وتعديل بوستترانسلاتيونالي (ريبس)4. وتصدر هذه العديد من الكائنات الحية من مملكة الفطريات والمجال للبكتيريا. واحد ريبس المعروفة والمستخدمة على نطاق واسع نيسين، وبطبيعة الحال التي تنتجها بكتيريا حمض الالكتيك لاكتيس لاكتوكوككوس (L. lactis). نشطة ضد فريق بكتيريا إيجابية، نيسين قد استخدمت بيوبريسيرفاتيفي في صناعة الأغذية لأكثر من 50 عاماً بسبب خصائصه المضادة للميكروبات، وغياب المقاومة تطورت في السلالات الجرثومية المستهدف5. وقد أظهرت الدراسات أن نيسين يزعزع ويولد المسام في أغشية الخلايا البكتيرية، مما يؤدي إلى نشاط مضادات الميكروبات ضد كل من الجراثيم إيجابية وسلبية الغرام6. ملزمة للدهن الثاني، هو توليف جدار الخلية البكتيرية تحول دون7. يتم ترميز نيسين النساء ببتيد سلائف خطية، التي تتألف من زعيم ومنطقة ببتيد أساسية (الشكل 1). بعد توليف ريبوسومال، يتم تعديل برينسين أولاً قبل ديهيدراتاسي نسب. هنا، بقايا سيرين وثريونين في منطقة كور بريبيبتيدي المجففة ديهيدروالانيني (Dha) وديهيدروبوتيريني (المجالس الصحية المحلية)8. لاحقاً، بقايا المجففة تقترن سيستين للنموذج لانثيونيني الخواتم (ومن ثم اسم “لانتيبيوتيك” للمضادات الحيوية التي تحتوي على حلقة لانثيونيني) بإضافة مايكل حفز إنزيم. هذا التعديل بوستترانسلاشونال (PTM) هو تحفزها cyclase كبيرة. في لاكتيس لام، ثم ينقل برينيسين تعديل الخروج من الزنزانة بالناقل نيست، وهو المشقوق الببتيد زعيم من البروتيناز نيسب بالإفراج عن نيسين الناضجة والنشطة نموذج9. Peptidase زعيم مسئول نسب خصوصية عالية الركازة، نظراً إلى أن العمليات فقط تعديل نيسين كفاءة10.
وبصفة عامة، يؤدي ريبس النشطة من عمل الإنزيمات PTM (على سبيل المثال نيسبك)، التي تزيد مساحة الكيميائية من الببتيدات قصيرة، مثلاً، عن طريق أسيتيليشن، جليكوسيليشن، مثلايشن أو الفسفرة جذريا. ويمكن توسيع هذا المستوى من التعقيد كذلك بإدراج مباشرة من ncAAs. في حين غالباً ما كان ذلك ممكناً، التوليف الكيميائي للمكاتب الإقليمية للمرأة يمثل تحديا للإنتاج على نطاق واسع بسبب تعقيدها الهيكلية. على سبيل المثال، أنجز توليف الكيميائية الإجمالية لاكتوسين لانتيبيوتيك S في 71 رد فعل الخطوات مع عائد نهائي من 10% وأن نيسين مع عائد النفط خام من11،0.003% فقط12. ولذلك، يقدم الإنتاج البيولوجي بديل قابل للتطبيق، بسبب توليد ستيريوسينتيرس الصحيح وتركيز المنتج عالية.
حتى اليوم، أكثر من 150 ncAAs، مثلاً، وجود المجموعات الوظيفية التي تحتوي على الفلور أو أزيدات، قد أدمجت في البروتينات المؤتلف، ومن عدة أمثلة لتعديل نكا الامبير قد تم الإبلاغ عن13،14، ،من 1516. مع الأخذ ncAAs، يمكن إنشاء الخصائص الفيزيائية الكيميائية الرواية مقارنة بالطفرات التقليدية. ويمكن زيادة تنوع الببتيدات القائمة، مما قد يؤدي إلى رواية المضادات الحيوية.
أسلوب واحد لإدراج ncAAs في الببتيدات المؤتلف إدماج الضغط الانتقائي (SPI) استناداً إلى استخدام السلالات البكتيرية أوكسوتروفيك17. هذه السلالات غير قادر على توليف التناظرية الجهاز المركزي للمحاسبات المقابلة من ncAA. يستخدم المنهجية خصوصية الركازة خففت كثيرا ما لوحظ، سمة من سمات العديد من أمينواسيل الطبيعية-الحمض الريبي النووي النقال سينثيتاسيس (آرس)18. وبصرف النظر عن على ركائز الجهاز المركزي للمحاسبات الطبيعية، هذه الإنزيمات غالباً ما تكون قادرة على الاعتراف وتنشيط نكا المرجوة وتوجيه الاتهام إلى ما tRNA(s) المشابهة. هذا يؤدي إلى إدراج ريبوسومال ncAA في المنتج الجينات المستهدفة بصورة خاصة ببقايا (أي هيئة الطيران المدني ← نكا الاستبدال). هذا هو بالطبع ممكناً إلا عندما نكا المطلوب مشابه كيميائيا وهيكليا للأحماض الأمينية المتعارف عليه وتتغاضى عن فسيولوجيا الخلية، والترجمة الآلية وتسلسل الببتيد أو البروتين الهدف. في إعداد تجريبية خاصة، تستزرع خلايا المضيف أوكسوتروفيك في متوسطة المعرفة المتوفرة مع تركيز الأحماض الأمينية الأصلي الاستعاضة عن الحد. النمو الخلوية أو الصرف بواسطة خالية من الجهاز المركزي للمحاسبات يؤدي إلى نضوب داخل الخلايا للجهاز المركزي للمحاسبات. في الخطوة التالية، يتم إضافة نكا وفعل التعبير الجيني المستهدف. لا محالة، ncAAs الآن أيضا مدرجة في العديد من البروتينات الأخرى في الخلية المضيفة أثناء هذه المرحلة من التعبير الجيني المستهدف. ومع ذلك، يتم الاحتفاظ سمية الإعداد SPI عند مستوى منخفض حيث تتحول سلالة الإشريكيّة القولونية (كولاي) مع بلازميد تحمل الجينات المستهدفة تحت سيطرة أحد المروجين القوى (عادة ذات قدرة تنافسية عالية T7 المروج/ رنا بوليميراز النظام)19. فورا بعد التعريفي (عادة عندما يتم استنفاد الجهاز المركزي للمحاسبات) والمضيف تتوقف الخلايا تنمو وأجهزتهما الانزيمية هيولى تستخدم أساسا للتعبير عن الهدف القائم على بلازميد الجينات. يمكن استخدام الطفرات الموجهة من الموقع لتحديد المواقع الخاصة ببقايا نكا التثبيت في الجينات الهدف20.
ببتيد نموذجي لإدراج ncAAs، اختير نيسين أمبير بينتاسيكليك A. الأحماض الأمينية 34 طويلة وبقايا برولين واحد فقط في تسلسل الببتيد الأساسية (الشكل 1). كما هو الحال في سوبتيليسين، أرسين A وق، وابيديرمين، وكذلك كما هو الحال في نيسين Z ونيسين Q، يبدو أن برولين المصانة أساسيا للنشاط9،21. برولين الجهاز المركزي للمحاسبات يلعب دوراً بالغ أهمية في بيبتيديل-بروليل أميد التناوب واستقرار الهيكل الثانوي. حلقة في سلسلة جانبية والتشكلات (exo/بوكيرس إندو) هي المسؤولة عن استقرار حراري للسندات أميد. غالباً خطيرة تؤثر التعديلات الكيميائية المستهدفة (مثل هيدروكسيليشنز، فلورينيشنز، ميثيليشنز) من ملمس بروليل الاستقرار والصلابة سقالة والوظائف للعديد من الهياكل البيولوجية22قابلة للطي. وبالتالي، فمن المعقول أن نتوقع أن يمنح استبدالات التناظرية برولين Pro→ خاتم ب، الحلقة الثانية من نيسين، مع الرواية وخصائص غير عادية.
هنا، برولين أوكسوتروفيك كولاي سلالة استخدمت لإنتاج نيسين المؤتلف. وهذا يتطلب التعبير عن الجينات بريبيبتيدي سورة النساء ، فضلا عن الجينات إنزيم التعديل نيسبك. يحمل المنتج الببتيد المرمز وراثيا زعيم صاحب معلم ن لا شفاء منها لتنقية عبر التقارب اللوني. لتحديد النشاط، ويستخدم لاكتيس L. معربا عن وإفراز نسبت لتنشيط الخيارين نيسين المؤتلف من ليساتيس كولاي الخلية أو عينات الببتيد المنقي (الشكل 1). يتم تحرير أمبير ناضجة بعد انشقاق الزعيم بنسب. في هذا الأسلوب نشر أجار، عينة أمبير ينشر في متوسط نمو متين ويمكن أن تعوق نمو الكائنات الدقيقة إيجابية. بعد حضانة، وهذا يمكن ملاحظة بصريا بهالات تثبيط النمو. بالإضافة إلى لاكتيس ل. كمؤشر، تعديل متغيرات نيسين أظهرت نشاط مضادات الميكروبات ضد فايكاليس البرازيةو المكوّرات العنقودية الذهبية، و الشمعية Bacillus جوهنسوني اكتوباكيللوس 21،23.
هو أسلوب بديل ومختلف تجريبيا لدمج ncAAs في ريبس كودون وقف قمع (المنبوذة)24. لهذا، الحمض الريبي النووي النقال متعامد/أمينواسيل-الحمض الريبي النووي النقال سينثاتيز (aaRS) زوج مطلوب نكا المقابلة. ومن الناحية المثالية، كل هذه المكونات الثلاث هي بيورثوجونال، أي أنها لا تتفاعل مع ترنس الذاتية وآرس. AaRS نكا محددة يمكن إنشاؤها بواسطة تعديل الموقع النشط في الإنزيم والفرز للمكتبات الوراثية سينثيتاسيس متحولة25. وعلاوة على ذلك، يتطلب الأخذ نكا كودون التي يتم إعادة تعيينها والتي غير والتي ترميز للجهاز المركزي للمحاسبات. عادة، هو كودون وقف العنبر تستخدم24،26.
في الآونة الأخيرة، أنشئت SPI لإدماج ncAAs المحتوية على تشلورواسيتاميدي α وانقر-الكيمياء-متوافق في سورة النساء27. على سبيل المثال، قد أدرج Nε-التخصيص-يسين كابتيستروين الببتيد ﻻسو بمواقع محددة (SCS) والخاصة بالمخلفات (SPI) إدماج أساليب المعدلة لاحقاً في المختبر التي حفزت الروثينيوم الناتج28 . بالمقارنة مع SPI، الأسلوب المنبوذة أكثر تعقيداً منذ الحمض الريبي النووي النقال متعامد/زوج aaRS يجب أن يكون أعرب عن المشاركة. حتى الآن، تم س-أزواج لإدماج برولين المتقدمة29، ولكن أفضل معرفتنا، لم يبلغ أي مثال التأسيس برولين التناظرية.
تجدر الإشارة إلى أن ncAAs ليست كلها يمكن إدراجها باستخدام منهجية SPI. أولاً، ينظم العديد من البروتينات النقل المضمنة في غشاء هيولى، وهي الغشاء الداخلي للبكتيريا سلبية الغرام مثل كولايامتصاص ncAAs في السيتوبلازم. عادة، يتم كولاي قادرة على نقل مجموعة واسعة من النظير من الأحماض الأمينية في الخلية مع سلاسل الجانب هيكلياً ومشابه كيميائيا للأحماض الأمينية المتعارف عليه. ثانيا، العديد من ncAAs رد الفعل أو غير مستقرة كيميائيا قد تعمل كمثبط اتجاه النمو الخلوي، حيث أنها سامة للتمثيل الغذائي وعلم وظائف الأعضاء المضيفة خلية30. وهكذا، بالاقبال وسمية نكا للمضيف الإنتاج ينبغي اختبار مسبقاً. لتجنب المنظمة إليه PTM كأثر جانبي، يمكن استخدام إعداد تعبير رقابة صارمة من المورثات المسؤولة لدمج الأحماض الأمينية الطبيعية الإنزيمات التعديل (مثلاً، نيسبك)، والرابطة الوطنية لرياضة في الجينات المستهدفة ( سورة النساء مثلاً،). هذا أن يمكن إنجاز باستخدام اثنين من المروجين مختلفة والتعريفي للتعبير الجيني المستهدف، كما هو موضح في البروتوكولات SPI المصممة خصيصا31. كما هو مبين أعلاه، يعتمد الأسلوب SPI على خصوصية الركازة استرخاء aaRS، الذي يسمح لتفعيل نكا والمشابهة الحمض الريبي النووي النقال الشحن. بعد ذلك، يتم تسليم الحمض الريبي النووي النقال الريبوسوم تليها أميد تشكيل السندات وقابلة للطي من الببتيد المستهدفة (بولي). في هذه العمليات، وتصحيح التجارب المطبعية، وتحرير آليات قد تصبح ذات الصلة32. لهذه الأسباب، فإنها ذات أهمية كبيرة ليكون هدفا نكا مشابهة كيميائيا وهيكليا للجهاز المركزي للمحاسبات. نقاط حاسمة أخرى هي الاستقرار كافية (سواء في وسائط الاستنبات ويتعرض الأيض الخلوية) وذوبان ncAA. بالإضافة إلى ذلك، فإنه ينبغي متوفرة تجارياً أو سهلة ليتم تصنيعه كيميائيا.
هنا، نحن وصف بروتوكول للحزب الاشتراكي الإيراني، السماح بإدراج خاصة ببقايا ncAAs في المؤتلف ريبس. خاصة، تدمج النظير برولين مختلفة نيسين الببتيد الميكروبات باستخدام كولاي كالكائن الحي المضيف. يتم استخدام الطيف الكتلي للتحقق من استبدال حمض أميني ويتم تحليل المنتجات الببتيد بيواكتيفيتي استخدام فحوصات تثبيط النمو والأسفار مجهرية باستخدام السلالات الجرثومية مؤشر.
يتطلب الشرط الأساسي للتعبير نيسين المؤتلف ناجحة مع ncAAs محددة مناسبة برولين أوكسوتروفيك كولاي سلالة. لهذا أوكسوتروفي، proA قد تكون مختلة، فعلى سبيل المثال حققت بالجينوم بالضربة القاضية. خلايا المحرومين تماما من داخل الخلايا برو الحيوي (أي حذف بروابك) دون إمكانية العودة أوكسوتروفس مستقرة. أساليب خروج المغلوب الجينات المستخدمة على نطاق واسع هي توصيل بالعاثية أو خروج المغلوب وحيدة الجين وفقا داتسينكو & وانير33. وعلاوة على ذلك، يمكن الحصول على سلالات proA خروج المغلوب من المستودعات العامة مثل أدجيني أو كجسك أو مجموعة كيو. منذ التعبير المؤتلف نيسابك هو موضح هنا تعتمد على استخدام المروجين T7, قد سلالة المضيف التعبير للقيام جينات إيندوسيبلي بوليميريز الحمض النووي الريبي T7. يمكن إنجاز هذا بإدخال بروفاجي λDE3 في جينوم المضيف، على سبيل المثال باستخدام مجموعة تجارية. وبدلاً من ذلك، يمكن إجراء سلالات مثل BL21(DE3) أوكسوتروفيك كما هو موضح أعلاه.
Protocol
Representative Results
Discussion
باستخدام SPI لإدراج النظير برولين، هياكل نيسين المستهدفة يمكن إلى حد كبير تعديل، إنشاء متغيرات الببتيد الرواية مع تركيبات تسلسل فريدة وخصائص المواد الكيميائية. وبهذه الطريقة، الحد الأساسي لتكنولوجيا الجينات الكلاسيكية يمكن التحايل عليها، التي هي مقيدة لكيمياء سلسلة جانبية من الهيئة 20. في فيفو الكيميائية تنويع نيسين كما يتضح أعلاه يدل على نهج عام لتكمل بتمس الطبيعية وتعزيز هائلة المساحة الكيميائية من ريبس. ونحن نعتقد أن توسيع مرجع الأحماض الأمينية الطبيعية يحمل وعدا كبيرا خاصة بالنسبة للمكاتب الإقليمية للمرأة. في البروتينات، يمكن تحقيق مجموعة هائلة من الوظائف من خلال ترتيب محدد للهيئة 20 في هياكل ثلاثية الأبعاد. مع فقط 7-100 ألف بطول3، سيكون السبل الكفيلة بتحقيق هذه السمات الهيكلية إلا من خلال الهيئة محدودة بالنسبة للمكاتب الإقليمية للمرأة. وبالتالي فإنه ليس من المستغرب أن الامبير الطبيعية في شكل ريبس يشيع على نطاق واسع بوستترانسلاتيونالي معدلة4. وبنفس الطريقة، ncAAs كلبنات البناء البديلة تبشر كبيرة لتحسين المعلمات ميكروبيولوجية والحرائك الدوائية الخاصة بهم (انظر باومان et al. عام 201735 والمراجع فيها).
SPI المنهجية المستخدمة في هذا فوائد العمل من الإعداد التجريبية سهلة نسبيا، والتنفيذ مباشرة وإمكانية تكرار نتائج عالية. سبب استبدال العالمية، من الممكن أيضا إدماج نكا المواقع المتعددة في الببتيدات المستهدفة. من ناحية أخرى، قد لا تكون الطريقة كافية لاستبدال الأحماض الأمينية التي كثيرا ما تحدث في منتج الجين المستهدف. من حيث المبدأ، يمكن تغيير مواقف غير مرغوب فيها بواسطة الطفرات الموجهة من الموقع، ولكن هذه التغييرات إضافية قد تؤثر أيضا على العديد من خصائص أمبير، بما في ذلك هيكل وبيواكتيفيتي. حالما يتوفر سلالة أوكسوتروفيك للإنتاج، يمكن أن يكون اختبار ncAAs عدة دون الحاجة إلى تغييرات واسعة النطاق على الصعيد الوراثي. وعلاوة على ذلك، الطريقة لا تقتصر على أوكسوتروفيك كولاي سلالات، ولكن يمكن أيضا إجراء باستخدام المضيف الإنتاج الطبيعي. على سبيل المثال، أظهرت تشو وآخرون أن SPI لإنتاج رواية ريبس يعمل أيضا بطبيعة الحال الحزب أوكسوتروف L. lactis: استخدام تعريف وسائط الإعلام، وأدرجت ثلاثة التربتوفان النظير في أربعة مواقع في نيسين50.
نظراً للأسلوب SPI ويؤدي إلى استبدال العالمي المختار الجهاز المركزي للمحاسبات نكا، وعموما ينطبق على طائفة واسعة من الببتيدات المستهدفة والبروتينات. مجموعة من أوكسوتروفيك كولاي سلالات يتوفر (راجع الخطوة 1)، السماح للهيئة عدة كل اختبار للاستبدال بواسطة ncAAs. اجتمع النظير إدراج استخدام metA-قصور سلالات (مثلاً، B834(DE3)) هي الأكثر استخداماً. أمثلة من نظائرها Met إيسوستروكتورال أزيدوهوموالانيني (اها) وهوموبروبارجيلجليسيني (Hpg)، ncAAs المتاحة تجارياً التي يمكن أن تدمج كفاءة. كل عرض مقابض بيورثوجونال التي تسمح للحجز على جزيئات تحمل على ألكاين متوافقة أو أزيد وظيفة، على التوالي. على سبيل المثال، يمكن إرفاق الأصباغ الفلورية أو مويتيس البولي إثيلين غليكول (شماعة) من النحاس (I)-حفز أزيد ألكاين سيكلواديشن (كواك)51.
على الرغم من أن كلا أساليب إدماج نكا المؤتلف (SPI والطوائف المنبوذة) عادة تحقيق الهدف كميات كافية، وكثيراً ما تخفض الغلال بالنسبة إلى الإنتاج البرية من نوع المقابلة الببتيدات والبروتينات. كما بورتيس غالباً ما ترتبط بكفاءة الإنتاج، قد تكون خطوات تنقية إضافية المطلوبة، خاصة بالنسبة للأنواع منخفضة وفيرة. في هذه الحالة بالذات لإنتاج نيسين المؤتلف، يبسط التسلسل الزعيم صاحب معلم إلى حد كبير شأن تنقية بتخصيب انتقائية من ليساتيس الخلية. يحسن نقاء وتركيز نيسين تنقية المبينة في هذا البروتوكول، ولكن غالباً ما لا تسفر عن بورتيس أمبير كافية لتحديد العائد ونشاط معين. وإلى جانب ايماك، تشمل أساليب تنقية أمبير استخداماً [هبلك] والتبادل الأيوني اللوني (IEC) وهطول الأمطار (مثلاً. استخدام الأسيتون أو حمض التريكلوروسيتيك (TCA)) أو مزيج منها-أسفر عن نظام تنقية متعددة الخطوات52 . من الجدير أن بهم عادة طبيعة بوليكاتيونيك يمكن أن يسهل تنقية اللجنة الانتخابية المستقلة. التجميد وكثيراً ما يستخدم لتخزين الامبير المنقي.
من الناحية المثالية، ينبغي أن تكون متاحة تجارياً وبأسعار معقولة ncAAs لإدماجها في المكاتب الإقليمية للمرأة أو التي تنتجها البروتوكولات التوليف الكيميائية البسيطة واستنساخه بسهولة. شرط نفس القدر من أهمية للأسلوب SPI هو أن ncAA المعترف بها، وتنشيط ويتقاضاها aaRS الذاتية أو أعربت عن المشاركة إلى الحمض الريبي النووي النقال المشابهة. وهذا يمكن اختبارها في المختبر بالأحماض الأمينية التنشيط أو الحمض الريبي النووي النقال أمينواسيليشن المقايسة53. كبديل سهل، أجريت على حد سواء في وجود SPI اختبار تعبيرات البروتينات النموذجية مثل البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) وفي غياب نكا مكملات يمكن أن يؤديها. وعلاوة على ذلك، تشكل القابلية للذوبان في نفاذية الخلية والمتوسطة النمو، فضلا عن الاستقرار الكيميائي عوامل هامة.
في هذا المثال، تم فحص نشاط مضادات الميكروبات باستخدام سلالة مؤشرات إيجابية. كما تعرب عن بيبتيداسي زعيم نسب، هو حفز الخطوة النهائية لنضوج نيسين. إزالة تسلسل الزعيم (صاحب الموسومة لأغراض تنقية) يمكن أيضا أن يؤديها في المختبر بالمعاملة مع تنقية50 أو التربسين نسب54. خارج نطاق هذا العمل، يمكن بعد ذلك اختبار الكائنات المسببة للأمراض والسلالات المقاومة للأدوية المتعددة لتثبيط والاريثروسين أو جراثيم بالأمبير باستخدام منهجية مماثلة. وتشمل الأنواع المستهدفة ذات الصلة سريرياً هذه الجرثومة والمقاوم بكتريا السل، فري، Acinetobacter baumannii، العقدية الرئوية، و الزائفة الزّنجاريّة و الكلبسيله الرئوية. وإلى جانب نشر لوحة أجار المقايسة المقدمة هنا، النمو تثبيط يمكن إجراء باستخدام الوسائط المناسبة السائل تلقيح مع الأنواع البكتيرية وتستكمل مع أمبير أيضا. استخدام أساليب تمييع مرق، يمكن تحديد تركيز الحد الأدنى المثبطة (MIC) استخدام الببتيدات نقية55. يمكن أيضا استخدام مقايسة النشاط المعروضة هنا لتقدير بيواكتيفيتي وفاعلية الحلول التي تحتوي على أمبير بالنسبة للمركبات الإشارة، نيسين المتاحة تجارياً على سبيل المثال.
إنتاج ريبس المؤتلف في كثير من الأحيان ممكناً39، التي تشمل عادة المشارك التعبير عن الجينات PTM. حالما يتم نقل إنتاج سلالة إلى وسيط الحد أدنى كيميائيا محددة أو الاصطناعية التي تحتوي على نكا مناسبة، يجري استبدال الخاصة بالمخلفات من الجهاز المركزي للمحاسبات المقابلة. وهكذا، يمكن أن تنتج ريبس الأخرى بنفس المنهجية، شريطة أن الممكن إنتاجها المؤتلف والظروف ويمكن الاطلاع فيها إدراج نكا و PTM تسفر عن كميات كافية من المنتج المستهدف. علما أن إلى جانب البروتين الخلية المضيفة، الآلية PTM الببتيد التي يمكن أن تصبح أيضا تعديل نكا خلال SPI. ونتيجة لذلك، توقيت الهدف التعبير التعريفي، وطول فترة الحضانة التالية يمكن أن تتطلب التحسين. حيث يمكن أن تؤثر على إدماج نكا الإنزيمات PTM استقرارها والنشاط، إنتاج شأن معالجة يمكن من حيث المبدأ أن تتأثر. تتم الإشارة إلى فعالية إنزيم PTM كافية بتشكيل بريبيبتيدي المجهزة، كما الكشف عنها بواسطة فحوصات مرض التصلب العصبي المتعدد وبيواكتيفيتي. كما عرضت أعلاه، المروجين إيندوسيبلي مختلفة يمكن استخدامها من أجل إنتاج PTM الجينات أولاً (في غياب ncAA) متبوعة بتحريض الجينات الببتيد السلائف في وجود ncAA. بشكل عام، يجب قمعها إنتاج ببتيد المستهدفة التي تحتوي على الجهاز المركزي للمحاسبات قبل إضافة نكا، ولهذا السبب مطلوب القمع ضيق من الجينات السلائف. ضمن هذا البروتوكول، ويتحقق ذلك من خلال القمع تقويضي من خلال إضافة السكر إلى متوسط النمو. لا سيما وأن الإنزيمات PTM المطلوبة لتجهيز بريبيبتيدي تنشأ عادة من مضيف بعيد وراثيا، التعبير درجة الحرارة وكودون استخدام الجينات المقابلة يمكن أن تتطلب الأمثل إذا لم يتم إنتاج المؤتلف المنشأة. من حيث المبدأ، يمكن أن تتداخل وجود ncAAs في بريبيبتيدي مع الاعتراف وتجهيز الإنزيمات PTM، في حالة نيسين نيسبك ونسب. لدمج نكا في المكاتب الإقليمية للمرأة، وبالتالي يوصي بالقيام بتجارب صغيرة التعبير أولاً لتحديد شروط التعبير المناسب والموثوقية لتحليل النشاط أمبير.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.H.N.، يد وم الاعتراف بالتمويل عن طريق برنامج FW7 الاتحاد الأوروبي (سينبيبتيدي). واو-ج. س. وأمورنا نعترف بالتمويل من جانب الوزارة الاتحادية للتعليم والعلوم (برنامج الفدرالية “HSP 2020″، والمشروع ويميبلوس تو سينتوبيو) ومؤسسة البحوث الألمانية (الكتلة للتميز “مفاهيم أونيفيينج في الحفز”).
Materials
| sodium chloride | Carl Roth, Germany | P029 | |
| guanidine hydrochloride | Carl Roth, Germany | 0035.2 | |
| dipotassium hydrogen phosphate | Carl Roth, Germany | P749.3 | |
| potassium dihydrogen phosphate | Carl Roth, Germany | 3904.3 | |
| sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Carl Roth, Germany | K300.2 | |
| disodium hydrogen phosphate | Carl Roth, Germany | P030.2 | |
| L-alanine | Carl Roth, Germany | 3076.2 | |
| L-arginine | Carl Roth, Germany | 3144.3 | |
| L-asparagine monohydrate | Carl Roth, Germany | HN23.1 | |
| L-aspartic acid | Carl Roth, Germany | T202.1 | |
| L-cysteine | Carl Roth, Germany | 3467.3 | |
| L-glutamine | Carl Roth, Germany | 3772.1 | |
| L-glutamic acid | Carl Roth, Germany | 3774.1 | |
| L-glycine | Carl Roth, Germany | 3187.3 | |
| L-histidine | Carl Roth, Germany | 3852.3 | |
| L-isoleucine | Carl Roth, Germany | 3922.3 | |
| L-leucine | Carl Roth, Germany | 3984.3 | |
| L-lysine monohydrate | Carl Roth, Germany | 4207.2 | |
| L-methionine | Carl Roth, Germany | 9359.4 | |
| L-phenylalanine | Carl Roth, Germany | 4491.2 | |
| L-proline | Carl Roth, Germany | T205.3 | |
| L-serine | Carl Roth, Germany | 4682.4 | |
| L-threonine | Carl Roth, Germany | T206.2 | |
| L-tryptophan | Carl Roth, Germany | 4858.2 | |
| L-tyrosine | Carl Roth, Germany | T207.2 | |
| L-valine | Carl Roth, Germany | 4879.4 | |
| ammonium sulfate | Carl Roth, Germany | 3746.3 | |
| magnesium sulfate | Carl Roth, Germany | 0261.2 | |
| D-glucose | Carl Roth, Germany | 6780 | prepare a 20% (w/v) solution for addition into molten agar |
| calcium chloride | Carl Roth, Germany | PN93.2 | |
| iron(II) chloride | Sigma-Aldrich, Germany | 372870 | |
| thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Germany | T1270 | |
| biotin | Carl Roth, Germany | 3822.2 | |
| copper(II) sulfate | Merck, Germany | 102792 | |
| manganese(II) chloride | Carl Roth, Germany | KK36.2 | |
| zinc chloride | Merck, Germany | 108816 | |
| immonium orthomolybdate | Sigma-Aldrich, Germany | 277908 | |
| glycerol | Carl Roth, Germany | 7533.3 | |
| isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich, Germany | I6758 | |
| ampicillin sodium salt | Carl Roth, Germany | K029.5 | working concentration 100 µg/mL for E. coli, prepare 100 mg/mL stock in ddH2O |
| kanamycin sulfate | Carl Roth, Germany | T832.2 | working concentration 50 µg/mL for E. coli, prepare 50 mg/mL stock in ddH2O |
| chloramphenicol | Carl Roth, Germany | 3886.1 | working concentration 5 µg/mL for L. lactis, prepare 37 mg/mL stock in ethanol |
| (4S)-fluoroproline | Bachem, Switzerland | F-3970 | |
| (4R)-fluoroproline | Bachem, Switzerland | F-3975 | |
| (4S)-hydroxyproline | Bachem, Switzerland | F-1395 | |
| (4R)-hydroxyproline | Bachem, Switzerland | F-2980 | |
| (4S)-methanoproline | chemically synthesized | ||
| (4R)-methanoproline | chemically synthesized | ||
| hydrochloric acid (HCl) | Carl Roth, Germany | P074.4 | |
| ethanol | VWR, Germany | 20825.324 | |
| M17-broth | Sigmal-Aldrich, Germany | 56156 | commercial product, see Terzaghi BE & Sandine WE, Appl Microbiol., 1975, 29(6):807-13 for contents and preparation |
| agar-agar | Carl Roth, Germany | 5210.5 | |
| Nisin from Lactococcus lactis | Sigma-Aldrich, Germany | N5764 | commercial product, can be used as reference for bioactivity |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Carl Roth, Germany | A994.1 | |
| imidazole | Carl Roth, Germany | 3899.3 | |
| 1.5 mL autosampler vial for LC-MS | Sigma-Aldrich, Germany | Supelco 854165 | |
| acetonitrile | VWR, Germany | HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642 | LC-MS grade required |
| formic acid | VWR, Germany | HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865 | LC-MS grade required |
| 1 mL Ni-NTA IMAC column, e.g. HisTrap FF Crude | GE Healthcare, UK | 29-0486-31 | different manufacturers and resins available for IMAC |
| 0.45 µm bottle top filter unit | VWR, Germany | 10040-470 | sterile filtration of solutions using a vacuum pump |
| 0.45 µm syringe filter PVDF membrane | Carl Roth, Germany | CCY1.1 | sterile filtration of solutions using a syringe and to remove particles from cell lysates |
| luer-lock syringe, PP, 50 ml | Carl Roth, Germany | T552.2 | sterile filtration of solutions |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf, Germany | 30120086 | |
| petri dishes (polystyrene, sterile) | Carl Roth, Germany | TA19 | |
| Nile red | Sigma-Aldrich, Germany | 72485 | |
| E. coli ΔproA strain | CGSC, Keio collection | JW0233-2 | proline-auxotrophic E. coli K-12 strain |
| E. coli B834(DE3) | Novagen (Merck), Germany | 69041 | methionine-auxotrophic E. coli B strain |
| λDE3 Lysogenization Kit | Novagen (Merck), Germany | 69734-3 | |
| Lactococcus lactis NZ9000 pNG nisPT | bacterial indicator strain, see Khusainov R & Kuipers OP, PLoS One, 8 (9), e74890 | ||
| benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf, Germany | 5427 R | |
| peristaltic pump | GE Healthcare, UK | P1 | |
| FPLC system | GE Healthcare, UK | Äkta Purifier 10 or the like | |
| inverted microscope | Nikon | TI Eclipse wide-field fluorescence microscope with 100x (N.A. 1.4) objective and Mercury Lamp | example setup for fluorescence microscopy |
| electron multiplying CCD (EMCCD) camera | Andor Technologies, UK | Andor Luca | example setup for fluorescence microscopy |
| fluorescence excitation filter | Thorlabs, USA | Dichroic cube (TLV-U-MF2-TRITC) | example setup for fluorescence microscopy |
| fluorescence emission filter | AHF Analysentechnik, Germany | T 560 LPXR | example setup for fluorescence microscopy |
| cover slip 24 x 60 mm | Carl Roth, Germany | LH26.1 | example setup for fluorescence microscopy |
| Immersion Oil | Carl Zeiss, Germany | Immersol 518 F | example setup for fluorescence microscopy |
| probe sonicator | Bandelin, Germany | Sonopuls HD3200 with sonotrode MS-72 | 200 W maximum HF output |
| C5 HPLC column (2.1×100 mm, 3 µm particle size) | Sigma-Aldrich, Germany | 567227-U | example setup for mass spectrometry |
| ESI-TOF coupled to HPLC system | Agilent, USA | Agilent 6530 Accurate Mass QTOF with 1260 HPLC | example setup for mass spectrometry |
References
- Ferri, M., Ranucci, E., Romagnoli, P., Giaccone, V. Antimicrobial resistance: A global emerging threat to public health systems. Crit Rev Food Sci Nutr. 57 (13), 2857-2876 (2017).
- Bahar, A. A., Ren, D. Antimicrobial peptides. Pharmaceuticals. 6 (12), 1543-1575 (2013).
- Ageitos, J. M., Sánchez-Pérez, A., Calo-Mata, P., Villa, T. G. Antimicrobial peptides (AMPs): Ancient compounds that represent novel weapons in the fight against bacteria. Biochem Pharmacol. 133, 117-138 (2017).
- Arnison, P. G., et al. Ribosomally synthesized and post-translationally modified peptide natural products: overview and recommendations for a universal nomenclature. Nat Prod Rep. 30 (1), 108-160 (2013).
- Lubelski, J., Rink, R., Khusainov, R., Moll, G. N., Kuipers, O. P. Biosynthesis, immunity, regulation, mode of action and engineering of the model lantibiotic nisin. Cell Mol Life Sci. 65 (3), 455-476 (2008).
- Shin, J. M., Gwak, J. W., Kamarajan, P., Fenno, J. C., Rickard, A. H., Kapila, Y. L. Biomedical applications of nisin. J Appl Microbiol. 120 (6), 1449-1465 (2016).
- Scherer, K. M., Spille, J. -. H., Sahl, H. -. G., Grein, F., Kubitscheck, U. The lantibiotic nisin induces lipid II aggregation, causing membrane instability and vesicle budding. Biophys J. 108 (5), 1114-1124 (2015).
- Jung, G. Lantibiotica – ribosomal synthetisierte Polypeptidwirkstoffe mit Sulfidbrücken und α,β-Didehydroaminosäuren. Angew Chemie. 103 (9), 1067-1084 (1991).
- Rink, R., et al. Lantibiotic structures as guidelines for the design of peptides that can be modified by lantibiotic enzymes. Biochemistry. 44 (24), 8873-8882 (2005).
- Lagedroste, M., Smits, S. H. J., Schmitt, L. Substrate Specificity of the Secreted Nisin Leader Peptidase NisP. Biochemistry. 56 (30), 4005-4014 (2017).
- Ross, A. C., Liu, H., Pattabiraman, V. R., Vederas, J. C. Synthesis of the lantibiotic lactocin S using peptide cyclizations on solid phase. J Am Chem Soc. 132 (2), 462-463 (2010).
- Fukase, K., et al. Synthetic Study on Peptide Antibiotic Nisin. V. Total Synthesis of Nisin. Bull Chem Soc Jpn. 65 (8), 2227-2240 (1992).
- Dumas, A., Lercher, L., Spicer, C. D., Davis, B. G. Designing logical codon reassignment – Expanding the chemistry in biology. Chem Sci. 6 (1), 50-69 (2015).
- Kuthning, A., Durkin, P., Oehm, S., Hoesl, M. G., Budisa, N., Süssmuth, R. D. Towards Biocontained Cell Factories: An Evolutionarily Adapted Escherichia coli Strain Produces a New-to-nature Bioactive Lantibiotic Containing Thienopyrrole-Alanine. Sci Rep. 6, 33447 (2016).
- Piscotta, F. J., Tharp, J. M., Liu, W. R., Link, A. J. Expanding the chemical diversity of lasso peptide MccJ25 with genetically encoded noncanonical amino acids. Chem Commun (Camb). 51 (2), 409-412 (2015).
- Hartman, M. C. T., Josephson, K., Lin, C. -. W., Szostak, J. W. An expanded set of amino acid analogs for the ribosomal translation of unnatural peptides. PLoS One. 2 (10), 972 (2007).
- Johnson, J. A., Lu, Y. Y., Van Deventer, J. A., Tirrell, D. A. Residue-specific incorporation of non-canonical amino acids into proteins: recent developments and applications. Curr Opin Chem Biol. 14 (6), 774-780 (2010).
- Ibba, M., Söll, D. Aminoacyl-tRNAs: setting the limits of the genetic code. Genes Dev. 18 (7), 731-738 (2004).
- Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
- Budisa, N., Steipe, B., Demange, P., Eckerskorn, C., Kellermann, J., Huber, R. High-level biosynthetic substitution of methionine in proteins by its analogs 2-aminohexanoic acid, selenomethionine, telluromethionine and ethionine in Escherichia coli. Eur J Biochem. 230 (2), 788-796 (1995).
- Rink, R., et al. Dissection and modulation of the four distinct activities of nisin by mutagenesis of rings A and B and by C-terminal truncation. Appl Environ Microbiol. 73 (18), 5809-5816 (2007).
- Kubyshkin, V., Durkin, P., Budisa, N. Energetic contribution to both acidity and conformational stability in peptide models. New J Chem. 40 (6), 5209-5220 (2016).
- Molloy, E. M., Field, D., O’Connor, P. M., Cotter, P. D., Hill, C., Ross, R. P. Saturation mutagenesis of lysine 12 leads to the identification of derivatives of nisin A with enhanced antimicrobial activity. PLoS One. 8 (3), 58530 (2013).
- Wang, L., Brock, A., Herberich, B., Schultz, P. G. Expanding the genetic code of Escherichia coli. Science. 292 (5516), 498-500 (2001).
- Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
- Anderson, J. C., Wu, N., Santoro, S. W., Lakshman, V., King, D. S., Schultz, P. G. An expanded genetic code with a functional quadruplet codon. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (20), 7566-7571 (2004).
- Zambaldo, C., Luo, X., Mehta, A. P., Schultz, P. G. Recombinant macrocyclic lanthipeptides incorporating non-canonical amino acids. J Am Chem Soc. 139 (34), 11646-11649 (2017).
- Al Toma, R. S., et al. Site-directed and global incorporation of orthogonal and isostructural noncanonical amino acids into the ribosomal lasso peptide capistruin. Chembiochem. 16 (3), 503-509 (2015).
- Chatterjee, A., Xiao, H., Schultz, P. G. Evolution of multiple, mutually orthogonal prolyl-tRNA synthetase/tRNA pairs for unnatural amino acid mutagenesis in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (37), 14841-14846 (2012).
- Budisa, N., Pal, P. P. Designing novel spectral classes of proteins with a tryptophan-expanded genetic code. Biol Chem. 385 (10), 893-904 (2004).
- Voller, J. -. s., Thi To, T. M., Biava, H., Koksch, B., Budisa, N. Global substitution of hemeproteins with noncanonical amino acids in Escherichia coli with intact cofactor maturation machinery. Enzyme Microb Technol. 106, 55-59 (2017).
- Moghal, A., Hwang, L., Faull, K., Ibba, M. Multiple Quality Control Pathways Limit Non-protein Amino Acid Use by Yeast Cytoplasmic Phenylalanyl-tRNA Synthetase. J Biol Chem. 291 (30), 15796-15805 (2016).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Engelke, G., Gutowski-Eckel, Z., Hammelmann, M., Entian, K. D. Biosynthesis of the lantibiotic nisin: genomic organization and membrane localization of the NisB protein. Appl Environ Microbiol. 58 (11), 3730-3743 (1992).
- Baumann, T., Nickling, J. H., Bartholomae, M., Buivydas, A., Kuipers, O. P., Budisa, N. Prospects of In vivo Incorporation of Non-canonical Amino Acids for the Chemical Diversification of Antimicrobial Peptides. Front Microbiol. 8, 124 (2017).
- Plat, A., Kluskens, L. D., Kuipers, A., Rink, R., Moll, G. N. Requirements of the engineered leader peptide of nisin for inducing modification, export, and cleavage. Appl Environ Microbiol. 77 (2), 604-611 (2011).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. J Vis Exp. , (2017).
- Shi, Y., Yang, X., Garg, N., van der Donk, W. A. Production of lantipeptides in Escherichia coli. J Am Chem Soc. 133 (8), 2338-2341 (2011).
- Hochuli, E., Bannwarth, W., Döbeli, H., Gentz, R., Stüber, D. Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent. Nat Biotechnol. 6 (11), 1321-1325 (1988).
- Zhang, Z., Marshall, A. G. A universal algorithm for fast and automated charge state deconvolution of electrospray mass-to-charge ratio spectra. J Am Soc Mass Spectrom. 9 (3), 225-233 (1998).
- JoVE Science Education Database. High-Performance Liquid Chromatography (HPLC). J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Dialysis: Diffusion Based Separation. J Vis Exp. , (2017).
- Khusainov, R., Kuipers, O. P. The presence of modifiable residues in the core peptide part of precursor nisin is not crucial for precursor nisin interactions with NisB- and NisC. PLoS One. 8 (9), 74890 (2013).
- Terzaghi, B. E., Sandine, W. E. Improved medium for lactic streptococci and their bacteriophages. Appl Microbiol. 29 (6), 807-813 (1975).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 82 (7-8), 518-529 (2015).
- . Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).
- van Hest, J. C. M., Tirrell, D. A. Efficient introduction of alkene functionality into proteins in vivo. Febs Lett. 428 (1-2), 68-70 (1998).
- Prince, A., et al. Lipid-II Independent Antimicrobial Mechanism of Nisin Depends On Its Crowding And Degree Of Oligomerization. Sci Rep. 6 (1), 37908 (2016).
- Zhou, L., et al. Incorporation of tryptophan analogues into the lantibiotic nisin. Amino Acids. 48 (5), 1309-1318 (2016).
- Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. G. Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation. Curr Protoc Chem Biol. 3 (4), 153-162 (2011).
- Abts, A., et al. Easy and rapid purification of highly active nisin. Int J Pept. 2011, 175145 (2011).
- Francklyn, C. S., First, E. A., Perona, J. J., Hou, Y. -. M. Methods for kinetic and thermodynamic analysis of aminoacyl-tRNA synthetases. Methods. 44 (2), 100-118 (2008).
- van Heel, A. J., et al. Production and Modification of Five Novel Lantibiotics Using the Promiscuous Nisin Modification Machinery. ACS Synth Biol. 5 (10), 1146-1154 (2016).
- Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. W. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat Protoc. 3 (2), 163-175 (2008).
