Identifizierung von Transkription Faktor Olig2 genomische Bindungsstellen in akut PDGFRα + Zellen durch Low-Zelle Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung Analyse gereinigt
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, das entwickelt ist, um die genomweite Bindung des Transkriptionsfaktors Oligodendrozyt 2 (Olig2) in akut gereinigte Brain Oligodendrozyt Vorläuferzellen (OPCs) analysieren durch Ausführen von niedrig-Zelle Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) , Bibliothek-Vorbereitung, Hochdurchsatz-Sequenzierung und bioinformatische Analyse der Daten.
Abstract
In Säugetierzellen ist Gentranskription die Interaktionen der transcriptional Faktoren mit genomischer DNA in einer Zelle Art bestimmten Weise geregelt. Geschlecht-spezifische Transkriptionsfaktoren gelten als wesentliche Rollen in der Zelle Spezifikation und Differenzierung während der Entwicklung spielen. ChIP, gepaart mit Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung (ChIP-Seq) ist weit verbreitet genomweite Bindungsstellen der Transkriptionsfaktoren (oder seinen zugehörigen Komplex) für die genomische DNA analysieren. Eine große Anzahl von Zellen sind jedoch erforderlich für einen standard ChIP-Reaktion, die es schwierig macht, die begrenzte Anzahl von isolierten Primärzellen oder seltene Zellpopulationen zu studieren. Um zu verstehen, der Regulierungsmechanismus Oligodendrozyt Abstammung-spezifische Transkription Faktor Olig2 in akut gereinigten Maus OPCs, eine detaillierte Methode mit ChIP-Seq um zu identifizieren, die genomweite Bindungsstellen des Olig2 (oder Olig2 Komplex) angezeigt wird. Das Protokoll erklärt zunächst, wie Platelet-derived Wachstumsfaktor-Rezeptor Alpha (PDGFRα) zu reinigen positive OPCs von mäusegehirnen. Als nächstes Olig2 Antikörper vermittelten ChIP und Bibliotheksbau erfolgen. Der letzte Teil beschreibt die bioinformatische Software und Verfahren für die Olig2 ChIP-Seq-Analyse verwendet. Zusammenfassend lässt sich sagen meldet dieses Papier eine Methode, die genomweite Bindungen der transcriptional Faktor Olig2 bei akut gereinigte Brain OPCs zu analysieren.
Introduction
Es ist wichtig zu untersuchen, das Protein (oder Protein-Komplex) DNA-Bindung und die epigenetischen Markierungen transkriptionelle regulationsnetzwerke in verschiedenen biologischen Prozesse zu bauen. Insbesondere können die Bindungen von Transkriptionsfaktoren, die genomische DNA eine wichtige Rolle bei der Genregulation, die Zelldifferenzierung und das Gewebeentwicklung spielen. Es ist ein leistungsfähiges Werkzeug für das studieren der transcriptional Regelung und epigenetischen Mechanismen Chromatin Immunopräzipitation (ChIP). Aufgrund der rasanten Fortschritte in der Technologie der nächsten Generation Sequenzierung dient die Analysen der Protein-DNA-Bindung und epigenetischen Markierungen1ChIP gepaart mit Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung (ChIP-Seq). Ein standard-ChIP-Seq-Protokoll erfordert jedoch etwa 20 Millionen Zellen pro Reaktion, die die Anwendung dieser Technik erschwert, wenn die Zelle begrenzt, wie isolierte Primärzellen und seltene Zellpopulationen ist.
Oligodendrozyt Linie Zellen einschließlich Oligodendrozyt Vorläuferzellen (OPCs) und Oligodendrozyten sind weit verbreitet im gesamten Gehirn und sind unerlässlich für die Entwicklung und Funktion des Gehirns. Als eine Art von Vorläuferzellen können OPCs Selbsterneuerung und Differenzierung. OPCs nicht nur als Stammväter für Oligodendrozyten dienen, sondern auch eine wichtige Rolle in der Ausbreitung der neuronalen Signalisierung durch die Kommunikation mit anderen Arten von Gehirn Zellen2. Frühere Studien haben vorgeschlagen, dass Geschlecht-spezifische Transkriptionsfaktoren wie Olig2 und Sox103,4Oligodendrozyt Entwicklung geregelt ist. Diese Transkriptionsfaktoren befanden sich an den Veranstalter oder Enhancer Regionen einige entscheidende Gene binden ihren Ausdruck während Oligodendrozyt Spezifikation und Differenzierung zu beeinflussen. Allerdings ist es schwierig, DNA-bindende Protein (oder Protein-Komplex) Interesse an akut gereinigte primäre OPCs mit einer sehr begrenzten Anzahl von Zellen zu identifizieren.
Dieses Protokoll beschreibt, wie die genomische DNA-Immunoprecipitated von Olig2 in gereinigten Maus OPCs Genom-weite Ebene mit ChIP-Seq-Technik systematisch zu erforschen. OPCs von mäusegehirnen waren akut durch Immunopanning gereinigt und in einem ChIP Experiment ohne Verbreitung in Vitro. Eine begrenzte Anzahl von OPCs erhalten Sie durch Immunopanning und reicht für standard-ChIP-Seq-Experimente. Hierin ist ein Low-Zelle-ChIP-Seq-Protokoll mit so niedrig wie 20 Tausend Zellen pro ChIP Reaktion für Transkriptionsfaktoren beschrieben. Kurz gesagt, waren vernetzte Zellen lysiert und beschallt durch ein Ultraschall-Gerät, das Chromatin zu scheren. Das geschert Chromatin wurde mit Olig2 Antikörper sowie Protein A-beschichtete Kugeln, um Olig2 Antikörper gebunden genomischer DNA auszufällen inkubiert. Nach der Elution von Protein A-beschichtete Perlen und umgekehrte Vernetzung war genomischer DNA durch Olig2 Antikörper ausgefällt durch Phenol-Chloroform Extraktion gereinigt. Das resultierende Produkt wurde quantifiziert und T-Tailing unterworfen, Grundierung glühen Vorlage Schalt- und Erweiterung, die Zugabe von Adaptern und Verstärkung, Bibliothek Größenauswahl und Reinigung Schritte für ChIP-Seq Bibliotheksbau.
Nach der Sequenzierung wurde die Qualität der raw liest aus der Probe vorbereitet mit Olig2 Transkription Faktor Antikörper und die Kontrollprobe analysiert. Minderwertige Basenpaare und Adapter mit lesen, dass Fragmente getrimmt wurden. Nächste, getrimmte liest wurden auf das Maus-Referenz-Genom ausgerichtet. Die genomischen Regionen, die wesentlich bereichert wurden, für ChIP liest, im Vergleich zu der Kontrollprobe als Peaks erkannt wurden. Bedeutende Gipfel, repräsentieren mögliche Transkription Faktor Bindungsstellen wurden gefiltert und in einem Genom-Browser visualisiert.
In diesem Protokoll beschriebene Methode ist vor allem im großen und ganzen für ChIP-Seq von anderen Transkriptionsfaktoren mit jeden Zelltyp der begrenzten Stückzahlen einsetzbar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Säugetier-gen Verordnung Netzwerke sind sehr komplex. ChIP-Seq ist eine leistungsfähige Methode zur genomweiten Protein-DNA-Wechselwirkungen zu untersuchen. Dieses Protokoll enthält Olig2 ChIP-Seq ausführen mithilfe von eine geringe Anzahl von gereinigten OPCs aus mäusegehirnen (so niedrig wie 20 Tausend Zellen pro Reaktion). Der erste wichtige Schritt für dieses Protokoll ist die Reinigung des OPCs von mäusegehirnen durch Immunopanning mit PDGFRα-Antikörper. Für positive Selektion der OPCs mit PDGFRα beschich…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JQW, XD, RCDD und YY wurden durch Zuschüsse aus den nationalen Instituten der Gesundheit R01 NS088353 gestützt; NIH Grant 1R21AR071583-01; die Staman Ogilvie Fonds-Memorial Hermann Foundation; die UTHealth Gehirn Initiative und CTSA UL1 TR000371; und ein Stipendium an der University of Texas System Neurowissenschaften und Neurotechnologie Research Institute (Grant #362469).
Materials
| Reagent/ Equipment | |||
| Banderiaea simplicifolia lectin 1 | Vector Laboratories | # L-1100 | |
| Rat anti-PDGFRa antibody | BD Bioscience | # 558774 | |
| Neural tissue dissociation Kit (P) | MACS Miltenyi Biotec | # 130-092-628 | |
| Accutase | STEMCELL technologies | # 07920 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | # 15596026 | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody | Millipore | # AB5320 | |
| Bioruptor Pico sonication device | Diagenode | # B01060001 | |
| True MicroChIP kit | Diagenode | # C01010130 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | # 15593031 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up kit | MACHEREY-NAGEL | # 740609 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher | # P11496 | |
| DNA SMART ChIP-Seq kit | Clontech Laboratories | # 634865 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Voulter | # A63880 | |
| GlycoBlue | Thermo Fisher | # AM9516 | |
| pico-green | Thermo Fisher | # P11496 | |
| D-PBS | Thermo Fisher | # 14190-144 | |
| SYBR Green master mix | Bio-Rad Laboratories | # 1725124 | |
| DMEM/F12 | Fisher Scientific | # 11-320-033 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Fisher Scientific | # 15140122 | |
| N-2 Supplement | Fisher Scientific | # 17502048 | |
| B-27 Supplement | Fisher Scientific | # 17504044 | |
| insulin | Sigma | # I6634 | Prepare 0.5 mg/ml insulin solution by dissolving 5 mg insulin in 10 ml water and 50 μl of 1 N HCl. |
| Bovine Serum Albumin, suitable for cell culture (BSA) | Sigma | # A4161 | Prepare 4% BSA solution by dissolving 4 g BSA in 100 ml D-PBS and adjust the pH to 7.4 |
| Fibroblast Growth Factor basic Protein, Human recombinant (bFGF) | EMD Millipore | # GF003 | |
| HUMAN PDGF-AA | VWR | # 102061-188 | |
| poly-D-lysine | VWR | # IC15017510 | Prepare 1 mg/ml poly-D-lysine solution by dissolving 10 mg poly-D-lysine in 10 ml water and dilute 100 times when using. |
| Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 100x15mm | VWR | # 25373-100 | |
| Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 150x15mm | VWR | # 25373-187 | |
| HBSS, 10X, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red | Fisher Scientific | # 14185-052 | |
| Trypan Blue | Stemcell Technologies | # 07050 | |
| protease inhibitor cocktail | Sigma | # 11697498001 | |
| Software | |||
| FastQC | [10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | Obtaining quality control metrics of raw and trimmed reads | |
| Trimmomatic 0.33 | [11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | Trimming and filtering raw reads | |
| GENCODE mm10 | ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gz | Mouse reference genome | |
| Bowtie2 2.2.4 | [12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | Aligning reads to a reference genome | |
| SAMTools 1.5 | [13] http://samtools.sourceforge.net/ | Converting SAM file into BAM format | |
| HOMER 4.9.1 | [14] http://homer.ucsd.edu/homer/ | Creating a tag directory and annotating enriched genomic regions with gene symbols | |
| R 3.2.2 | [15] https://www.R-project.org/ | Programming scripts and running functions | |
| SPP 1.13 | [16] https://github.com/hms-dbmi/spp | Creating a strand cross-correlation plot | |
| MACS2 2.2.4 | [17] https://github.com/taoliu/MACS | Finding regions of ChIP enrichment over control | |
| BEDTools 2.25 | [18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ | Genome arithmetics | |
| bedGraphToBigWig | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/ | Converting bedGraph file into bigwig | |
| IGV browser 2.3.58 | [19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/ | Visualization and browsing of significant ChIP-seq peaks | |
| Microsoft Excel | Spreasheet program | ||
| ENCODE's blacklist | https://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklists | Filtering peaks | |
| mm10.chrom.sizes | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes. | Converting bedGraph file into bigwig | |
| ENCODE's motif database | [25] http://compbio.mit.edu/encode-motifs/ | Comprehensive motif database required for motif enrichment | |
| MEME-ChIP | [20] http://meme-suite.org/index.html | Motif enrichment analysis and motif discovery | |
| Primer names used for qPCR | Primer sequences used for qPCR | ||
| Mbp-F: | CTATAAATCGGCTCACAAGG | ||
| Mbp-R: | AGGCGGTTATATTAAGAAGC | ||
| Iba1-F: | ACTGCCAGCCTAAGACAACC | ||
| Iba1-R: | GCTTTTCCTCCCTGCAAATCC | ||
| Mog-F: | GGCTTCTTGGAGGAAGGGAC | ||
| Mog-R: | TGAATTGTCCTGCATAGCTGC | ||
| GAPDH-F | ATGACATCAAGAAGGTGGTG | ||
| GAPDH-R | CATACCAGGAAATGAGCTTG | ||
| Tuj1-F | TTTTCGTCTCTAGCCGCGTG | ||
| Tuj1-R | GATGACCTCCCAGAACTTGGC | ||
| PDGFRα-F | AGAGTTACACGTTTGAGCTGTC | ||
| PDGFRα-R | GTCCCTCCACGGTACTCCT |
References
- Wu, J. Q., et al. Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line. PLoS Genet. 8 (3), e1002565 (2012).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Intrinsic and extrinsic control of oligodendrocyte development. Curr Opin Neurobiol. 23 (6), 914-920 (2013).
- Liu, Z., et al. Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms. Dev Biol. 302 (2), 683-693 (2007).
- Dong, X., et al. Comprehensive Identification of Long Non-coding RNAs in Purified Cell Types from the Brain Reveals Functional LncRNA in OPC Fate Determination. PLoS Genet. 11 (12), e1005669 (2015).
- Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures. J Vis Exp. (10), e562 (2007).
- Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868 (2013).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Cheng, X., et al. Bone morphogenetic protein signaling and olig1/2 interact to regulate the differentiation and maturation of adult oligodendrocyte precursor cells. Stem Cells. 25 (12), 3204-3214 (2007).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Team, R. C. A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2015).
- Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nat Biotechnol. 26 (12), 1351-1359 (2008).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
- Bailey, T. L., et al. MEME SUITE: tools for motif discovery and searching. Nucleic Acids Res. 37 (Web Server issue), W202-W208 (2009).
- Sims, D., Sudbery, I., Ilott, N. E., Heger, A., Ponting, C. P. Sequencing depth and coverage: key considerations in genomic analyses. Nat Rev Genet. 15 (2), 121-132 (2014).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Mazzoni, E. O., et al. Embryonic stem cell-based mapping of developmental transcriptional programs. Nat Methods. 8 (12), 1056-1058 (2011).
- Kheradpour, P., Kellis, M. Systematic discovery and characterization of regulatory motifs in ENCODE TF binding experiments. Nucleic Acids Res. 42 (5), 2976-2987 (2014).
- Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation. J Neurosci. 26 (43), 10967-10983 (2006).
- Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645 (2012).
- Raskatov, J. A., et al. Modulation of NF-kappaB-dependent gene transcription using programmable DNA minor groove binders. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1023-1028 (2012).
- Cheneby, J., Gheorghe, M., Artufel, M., Mathelier, A., Ballester, B. ReMap 2018: an updated atlas of regulatory regions from an integrative analysis of DNA-binding ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. , (2017).
- Yevshin, I., Sharipov, R., Valeev, T., Kel, A., Kolpakov, F. GTRD: a database of transcription factor binding sites identified by ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D61-D67 (2017).
- Kulakovskiy, I. V., et al. HOCOMOCO: a comprehensive collection of human transcription factor binding sites models. Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D195-D202 (2013).
- Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. Active promoters give rise to false positive ‘Phantom Peaks’ in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. 43 (14), 6959-6968 (2015).
- Gerstein, M. B., et al. Architecture of the human regulatory network derived from ENCODE data. Nature. 489 (7414), 91-100 (2012).
