Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Rafael E. Flores-Obando; Mona M. Freidin; Charles K. Abrams

doi:10.3791/57543

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Neuroscience

Isolation de Immunomagnetic rapide et spécifique de souris primaire Oligodendrocytes

Published: May 21, 2018

doi:

10.3791/57543

Rafael E. Flores-Obando¹, Mona M. Freidin², Charles K. Abrams²

¹Program in Molecular and Cellular Biology,State University of New York Downstate Medical Center, ²Department of Neurology and Rehabilitation,University of Illinois at Chicago

Summary

Nous décrivons l’isolement immunomagnetic des oligodendrocytes principal de la souris, qui permet d’isoler des cellules in vitro culture rapide et spécifique.

Abstract

L’isolement efficace et robuste et la culture des oligodendrocytes primaires (MCO) est un outil précieux pour l’étude in vitro de l’élaboration des oligodendrocytes ainsi que la biologie des maladies comme la sclérose en plaques démyélinisantes et Maladie de Pelizaeus-Merzbacher-like (PMLD). Ici, nous présentons un simple et méthode de sélection efficace pour l’isolation immunomagnetic de stade trois O4⁺ cellules preoligodendrocytes de petits souris néonatales. Comme OL immature constituent plus de 80 % de la matière blanche de cerveau de rongeurs à jour après la naissance 7 (P7) cette méthode d’isolement assure non seulement le cellulaire à haut rendement, mais aussi l’isolement spécifique du BSL déjà engagé envers la lignée oligodendrogliale, diminuant la possibilité d’isoler les cellules contaminantes telles que les astrocytes et les autres cellules du cerveau de souris. Cette méthode est une modification des techniques rapportées antérieurement et assure une pureté préparation oligodendrocyte au-dessus de 80 % en environ 4 h.

Introduction

Oligodendrocytes (OLs) sont les cellules myélinisantes du système nerveux central (SNC)¹. L’isolement et la culture des oligodendrocytes primaires dans un environnement fortement réglementé est un outil précieux pour l’étude in vitro de l’élaboration des oligodendrocytes ainsi que la biologie des maladies telles que la sclérose^{2 démyélinisantes}. Cela nécessite un oligodendrocyte efficace et robuste d’isolement et de la culture la méthode³. Dans cette étude, nous avons profité de l’expression d’un marqueur de surface de cellule oligodendrocyte distinctif pour mettre en œuvre une technique d’isolation modifiée qui est rapide et précis.

Quatre étapes distinctes de la maturation des oligodendrocytes ont été identifiés, chacun caractérisé par l’expression des marqueurs de surface de cellules distinctes pour chaque stade de développement (Figure 1). Ces marqueurs de surface cellulaire peuvent être reconnus par des anticorps spécifiques⁴^,⁵et peuvent être utilisés pour isoler les langues officielles à des étapes spécifiques. Dans un premier temps, cellules de précurseurs d’oligodendrocytes (OPCs) ont la capacité à proliférer, de migrer et de façon explicite de facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF-Rα) de récepteur⁶, ganglioside A2B5, protéoglycane NG2⁷^,⁸, polysialic acide-neural cell adhesion molécule⁹ et gras-acid-binding protein 7 (FABP7)¹⁰. OPCs ont une morphologie bipolaire avec peu de processus abrégé émanant des pôles opposés du corps cellulaire, qui est caractéristique des précurseurs neuronaux de cellules¹¹.

Figure 1 : Expression de marqueurs de surface cellulaire lors du développement d’oligodendrocyte souris. Opération survie cellulaire marqueurs de surface tels que A2B5, GalC (O1), NG2, O4 et PDGF-Rα peuvent servir à isoler spécifiquement les oligodendrocytes au stade de développement spécifique en utilisant des anticorps spécifiques. Veuillez cliquer ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Dans un deuxième temps, OPCs donnent lieu à la preoligodendrocytes et exprimer à la membrane cellulaire non seulement des marqueurs OPC, mais aussi le Sulfoglycosphingolipides (un galactolipide sulfatée) reconnu par le O4 anticorps¹²^,¹³et la protéine de GPR17¹⁴, qui persiste jusqu’au stade d’oligodendrocytes immatures (OL). À ce stade, preoligodendrocytes étendre les processus abrégés multipolaires. Preoligodendrocytes sont l’étape majeure d’OL à jour après la naissance 2 (P2) dans la substance blanche cérébrale de rat et de souris avec une population mineure d’immatures OLs¹⁵.

Au cours de la troisième phase, OLs immatures continuent à exprimer O4, perdre l’expression des marqueurs A2B5 et NG2 et commencent à exprimer les galactocérébrosides C¹⁶. À ce stade, opération Survie au Soudan se sont engagés à la lignée oligodendrocyte et deviennent des cellules post-mitotiques avec des branches bien ramifiées¹⁷^,¹⁸. À cette époque les premières cellules MBP⁺ on observe¹⁵^,¹⁹^,²⁰^,²¹et OL immature constituent plus de 80 % de la matière blanche rongeur à P7. Par conséquent, isolement des langues officielles à P7 pourrait garantir cellulaire à haut rendement.

Dans la finale et quatrième étape du développement de l’OL, OLs matures expriment myélinisantes protéines (la protéine basique de la myéline (MBP), protéine protéolipidique (PLP), glycoprotéine myéline associée (MAG) et la myéline oligodendrocyte glycoprotéine (MOG)²²^,²³ ^,²⁴^,²⁵^,²⁶. À ce stade, OLs matures s’étendent les membranes ce compact de forme Envellopants gaines autour des axones et peuvent myéliniser. Cela coïncide avec l’observation que, dans le cerveau de rat et de souris, les cellules MBP⁺ deviennent plus en plus abondantes à P14¹⁹^,²⁰^,²¹.

Depuis le premier isolement des oligodendrocytes par fifi et ses collègues en 1967²⁷, plusieurs méthodes pour l’isolement des langues officielles de la CNS du rongeur ont été appliquées, y compris immunopanning²⁸^,²⁹^,³⁰, cellule activée par fluorescence triant (FACS) exploitant cell surface spécifique antigènes²⁸^,³¹, centrifugation en gradient différentiel³²^,³³^,³⁴^,³⁵et secouant méthode fondée sur l’adhésion différentielle des différents CNS glia³⁶^,³⁷. Cependant, les méthodes existantes de la culture ont des limites, notamment en termes de pureté, de rendement et de temps requis pour exécuter les procédures³⁸. Par conséquent, des méthodes d’isolation plus efficaces pour les oligodendrocytes sont nécessaires.

Dans cet article, nous présentons un simple et méthode de sélection efficace pour l’isolation immunomagnetic de stade trois O4⁺ cellules preoligodendrocytes de petits souris néonatales. Cette méthode est une modification des techniques signalées par Emery et al. ³⁹ et Dincman et al. ⁴⁰ et assure une oligodendrocyte préparation une pureté supérieure à 80 % en environ 4 h.

Protocol

Les souris utilisées dans cette étude ont été pris en charge conformément aux directives de la numéro de protocole de SUNY Downstate Medical Center Division du laboratoire Animal Resources (DLAR) 15-10492. Remarque : Les oligodendrocytes primaires ont été isolées de néonatale (P5-P7 sauvage C57Bl/6N) souris. À ce stade, OLs immatures constituent plus de 80 % de la matière blanche rongeur assurant un rendement cellulaire élevé. Tous les tampons et les compositions de réactif son…

Representative Results

Le but de cette étude était d’établir une méthode d’isolation améliorée pour O4+ oligodendrocytes souris primaire nécessitant la moins possible manipulation des cellules cibles. L’ensemble de la procédure de l’euthanasie des petits au bordé des cellules en lamelles prend environ 4 h et les données présentées ici représentent trois expériences indépendantes. Après dissociation tissulaire, une moyenne de 4,3 ± 0,46 x 107 cellules ont été isol…

Discussion

Dans cette communication, nous présentons une méthode pour l’isolation efficace des cultures d’oligodendrocytes immatures hautement purifié de la souris. Par rapport aux protocoles précédemment publiés³⁹^,⁴⁰, cette méthode a donné un degré de pureté supérieur à un niveau bien inférieur des astrocytes GFAP-positive et un très faible pourcentage des autres cellules non caractérisée. Il est important de souligner que ce sont immatures OLs déjà i…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été financée par des subventions de la National Multiple Sclerosis Society (RG4591A1/2) et le National Institutes of Health (R03NS06740402). Les auteurs remercient Dr Ivan Hernandez et les membres de son laboratoire pour fournir des conseils, des équipements et des laboratoires.

Materials

10ml serological pipets	Fisher Scientific	13-676-10J
10ml syringe Luer-Loc tip	BD, Becton Dickinson	309604
15ml conical tubes	Falcon	352097
24-well tissue culture plates	Falcon	353935
40µm cell strainer	Fisher Scientific	22368547
50ml conical tubes	Falcon	352098
5ml serological pipets	Fisher Scientific	13-676-10H
60mm tissue culture plates	Falcon	353002
70µm cell strainer	Fisher Scientific	22363548
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody	Invitrogen	A11001
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody	Invitrogen	A21042
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody	Invitrogen	A11008
Alexa Fluor 594 goat anti-chicken IgG (H+L) secondary antibody	Invitrogen	A11042
Anti-O4 beads- Anti-O4MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-094-543
Apo-Transferrin human	Sigma	T1147
Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml	USA Scientific	6032-1101
Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml	USA Scientific	6032-1102
B27 Supplement	Invitrogen	17504-044
Boric acid	Sigma	B7660
Bovine Growth Serum (BGS)	GE Healthcare Life Sciences	SH30541.03
BSA	Fisher Scientific	BP-1600-100
CNTF	Peprotech	450-50
d-Biotin	Sigma	B4639
Desoxyribonuclease I (DNAse I)	Worthington	LS002007
EDTA	Fisher Scientific	S311
Epifluorescence microscope with an Olympus DP70 camera	Olympus	Bx51
Feather disposable scalpels	Andwin Scientific	EF7281C
Forskolin	Sigma	F6886
German glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round	NeuVitro	GG-12-oz
GFAP antibody	Aves	GFAP
Glucose	Fisher Scientific	D16-1
GlutaMAX	Invitrogen	35050-61
Insulin	Invitrogen	12585-014
Magnetic separator stand – MACS multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Magnetic separator-MiniMACS separator	Miltenyi Biotec	130-042-302
Millex PES 0.22µm filter unit	Millipore	SLG033RS
Mounting media- Prolong Gold with DAPI	Thermo Fisher	P36930
N-acetyl-cysteine (NAC)	Sigma	A8199
Natural mouse laminin	Invitrogen	23017-015
Neurobasal Medium A	Invitrogen	10888-022
Neurotrophin-3 (NT-3)	Peprotech	450-03
NG2 antibody	Millipore	AB5320
Papain	Worthington	LS003126
PBS without Ca2⁺ and Mg2⁺	Sigma	D5652
PDGF	Peprotech	100-13A
Petri dishes	Falcon	351029
Poly-D-Lysine	Sigma	P6407
Primocin	Invivogen	ant-pm-2
Progesterone	Sigma	P8783
Putrescine	Sigma	P5780
Selection column-LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
Sodium Selenite	Sigma	S5261
Trace elements B	Corning	25-000-CI
Triiodothyronine (T3)	Sigma	T6397
Triton-X	Sigma	T8787
Trypan Blue Solution	Corning	25-900-CI
Tween 20	Sigma	P1379
B27NBMA			487.75 mL Neurobasal Medium A; 10 mL B27 Supplement; 1 mL Primocin; 1.25 mL Glutamax; Filter sterilize and store at 4 °C until use.
B27NBMA + 10% BGS			27 mL B27NBMA; 3 mL Bovine growth serum
CNTF solution stock (10 µg/ml; 1000X)			Order from Peprotech (450-50). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to Manufacturer’s instruction (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80 °C. Working solution (10 µg/ml, 1000X) 1. Make on 0.2% BSA (Fisher scientific BP-1600-100) in DPBS solution and filter sterilize. 2. Dilute master stock aliquot to 10µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS. 3. Aliquot (20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen. 4. Store aliquots at -80 °C.
d-Biotin stock solution (50 µg/ml; 5000X)			Resuspend d-Biotin (Sigma-B4639) in double-distilled H2O at 50 µg/ml (e.g. 2.5 mg in 50 ml of ddH2O). Resuspension might take fair amount of agitation/vortexing, or mild warming briefly at 37°C. If the d-Biotin still will not solubilize, it is fine to make up a less concentrated (e.g. 10µg/ml), and to add a higher volume to the B27NBMA (1/1000), instead of 1/5000). Store at 4°C.
DNase I stock solution			1. Dissolve at 12,500 U Deoxyribonuclease I / ml in HBSS chilled on ice. 2. Filter sterilize on ice 3. Aliquot at 200 µl and freeze overnight at -20°C. 4. Store aliquots at -20 to -30°C.
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (w/o Ca2+ and Mg2+)			Dissolve pouch in 1 Liter of water to yield 1 liter of medium at 9.6 grams of powder per liter of medium. Store at 2-8 °C.
Forskolin stock solution (4.2 mg/ml; 1000X)			Add 1 ml of sterile DMSO to 50 mg Forskolin in bottle (Sigma-F6886) and pipette until resuspended. Transfer to a 15 ml centrifuge tube and add 11 ml of sterile DMSO to bring to 4.2 mg/ml. Aliquot (e.g. 20 µl) and store at -20°C.
Hank’s balanced salts (HBSS) (Sigma			1. Measure 900 ml of water (temperature 15-20 °C) in a cylinder and stir gently. 2. Add the power and stir until dissolved. 3. Rinse original package with a small amount of water to remove all traces of the powder. 4. Add to the solution in step 2. 5. Add 0.35 gr of sodium bicarbonate (7.5% w/v) for each liter of final volume. 6. Keep stirring until dissolved. 7. Adjust the pH of the buffer while stirring to 0.1-0.3 units below pH= 7.4 since it may rise during filtration. The use of 1N HCl or 1N NaOH is recommended to adjust the pH. 8. Add additional water to bring the final volume to 1L. 9. Sterilize by filtration using a membrane with a porosity of 0.22 microns. 10. Store at 2-8 °C.
Insulin stock solution (4000 µg/ml)			Thaw the bottle and aliquot 25 µl per microcentrifuge tube and store at -20°C.
Laminin solution			Slowly thaw laminin in the cold (2°C to 8°C) to avoid gel formation. Then, aliquot into polypropylene tubes. Store at 5° C to -20° C in aliquots (e.g. 20 µl) and do not freeze/thaw repeatedly. Laminin may be stored at these temperatures for up to six months.
Magnetic Cell Sorting (MCS) Buffer			Prepare the solution containing phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.2, and 0.5% bovine serum albumin (BSA), 0.5 mM EDTA, 5µg/ml Insulin, 1 g/L Glucose. Sterilize and degas by filtration the buffer by passing it through a 0.22 µm Millex filter. Store the buffer at 4°C until use
N-Acetyl-L-cysteine (NAC) stock solution (5mg/ml; 1000X)			Dissolve N-Acetyl-L-cysteine (Sigma-A8199) at 5 mg/ml in DMEM (e.g. 50 mg NAC in 10 ml B27NBMA). Filter sterilize and aliquot (e.g. 20 µl). Store at -20°C.
NT3 stock solution (1 µg/ml; 1000X)			Master stock: Order from Peprotech (450-03). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer’s instructions (may vary from lot to lot), in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80°C. Working stock (1µg/ml; 1000X): 1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize. 2. Dilute master stock aliquot to 1 µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS. 3. Aliquot (e.g. 20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen. 4. Store aliquots at -80°C.
PDGF stock solution (10 µg/ml; 1000X)			Master stock: Order from Peprotech (100-13A). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer’s instructions (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS) + 0.2% BSA). Store at -80°C. Working stock (1µg/ml; 1000X): 1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize. 2. Dilute master stock aliquot to 1µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS. 3. Aliquot (e.g. 20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen. 4. Store aliquots at -80°C.
Poly-D-lysine (1mg/ml; 100X)			Resuspend poly-D-lysine, molecular weight 70-150 kD (Sigma P6407) at 0.5mg/ml in 0.15M boric acid pH 8.4 (e.g. 50mg in 50ml borate buffer). Filter sterilize and aliquot (e.g. 100µl/tube). Store at -20°C. Prior to use, dilute the 100X stock (1mg/ml) to 50 µg/ml in sterile water.
Oligodendrocyte proliferation media			see Supplementary Table 1
Oligodendrocyte differentiation media			see Supplementary Table 1
Sato supplement (100X)			see Supplementary Table 1
References: the list of reagents and recipes were adopted from the protocols previously described by Emery et. al. 2013 (Emery, B. & Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) and Dincman et. al. (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. & Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012))

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Flores-Obando, R. E., Freidin, M. M., Abrams, C. K. Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes. J. Vis. Exp. (135), e57543, doi:10.3791/57543 (2018).

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