Интегрировать изображений проточной цитометрии и транскриптомики, профилирование для оценки измененных Endocytic CD1d торговля
Summary
Imaging проточной цитометрии предоставляет идеальный подход для выявления морфологических и функциональных изменений клеток на индивидуальном и популяционной уровнях. Нарушается функция endocytic для презентации антигена липидов в подвергшихся воздействию загрязнителей дендритных клетках человека была продемонстрирована с профилирования комбинированных транскриптомики экспрессии генов и морфологических демонстрации оборота белка.
Abstract
Популяционной анализа морфологических и функциональных изменений endocytic белков сложной из-за спроса захвата изображения на одну ячейку анализа уровня и статистические изображений на популяционной уровне. Для преодоления этой трудности, мы использовали визуализации проточной цитометрии и транскриптомики, профилирование (РНК seq) для определения измененных субцеллюлярные локализации Кластер дифференцировки 1d белка (CD1d) связанные с нарушением endocytic ген выражение в человека дендритные клетки (DCs), которые были подвержены общей липофильных воздушных загрязнителей бензо [а] пирена. Colocalization CD1d и endocytic маркер Lamp1 белков из тысячи клеток изображения, снятые с imaging проточной цитометрии было проанализировано, используя идеи и ImageJ-Фиджи программы. Многочисленные сотовой изображения с совместно окрашенных CD1d и Lamp1 белки были визуализирована после стробирования на CD1d+Lamp1+ РС с помощью идей. Расширение CD1d и Lamp1 colocalization на Бат экспозиции далее была продемонстрирована с помощью показатели scatterplots, протестированы с Мандер в коэффициенты для совместного локализованных интенсивности и нанесены на основе доли совместно локализованных участков с помощью ImageJ-Фиджи. Наши данные обеспечивают выгодно инструментальная и bioinformatic подход для измерения colocalization белка на как одного, так и популяционной сотовой уровнях, поддерживая зрением функциональный результат транскриптомики изменения в подвергшихся воздействию загрязнителей человека РСУ.
Introduction
Презентация антигена, как правило, включает внутриклеточных белков людьми, который часто исследовано с помощью морфологических характеристик и фенотипические профилирование антиген представляющих клеток в1,2,3 . Чтобы интегрировать преимущества изображений и методов фенотипа, мы описываем анализа платформа отображения информации на одну ячейку и численности населения продемонстрировать измененный белок colocalization дендритных клеток человека (DCs). В презентации антигена пептидный комплекс гистосовместимости (MHC) сорта молекул привязать короткие пептиды (8-10 остатков) в эндоплазматический ретикулум активировать обычных CD8 клетки+ T, хотя II молекул MHC класса привязки относительно больше пептид (~ 20 остатков) в endocytic отсеках для активации обычных CD4 клеток+ T1,4. В противоположность этому липидов специфичные Т-клетки активируются CD1 белки с антигенами липидов, главным образом в endocytic отсеков5,6. Презентация антигена липидов требует питания липидов метаболитов в липидного метаболизма7,8,9,10 и загрузка функциональных липидов метаболитов CD1 белки в endocytic отсеков5,6. В этом контексте различных клеточных факторов, модулирует презентации антигена липидов, особенно в экологические воздействия липофильных загрязнителей и иммунных, важно определить. В этом исследовании мы использовали транскриптомики анализ, профилирование изображения и клеточных и популяционной изображений анализ человека моноцитарных DCs для определения торговли endocytic белка, способствует презентации антигена липидов в воздействия широкого круга загрязнителей. Конечно это комбинированные платформы может применяться для изучения торговли внутриклеточных белков и colocalization в различных биологических процессах.
Технически локализация внутриклеточных белков обычно была продемонстрирована с помощью конфокальной микроскопии и статистически проанализированы в ограниченное количество обнаруженных клетки1,2,3,11. Кроме того проточной цитометрии широко применяется для ворот клеточных популяций с совместно окрашенных сигналов нескольких белков на клеточном уровне12; Однако это не хватает подробной визуализации внутриклеточных белков colocalization. Для достижения всеобъемлющего и статистический анализ процент белка colocalization на уровнях как клеточного, так и населения, мы внедряем изображений профилирования и анализ подходов для определения функции белка colocalization с биологического актуальность. В частности, мы используем изображений проточной цитометрии для обнаружения colocalization CD1d и лизосомальных связанные мембранный белок 1 (Lamp1) белки в этом исследовании. Количественный анализ colocalized молекул был ранее трудно выполнить в популяционной масштабе. В этом исследовании мы адаптировали ImageJ-Фиджи программа для изучения процент белка colocalization с большим числом совместно окрашенных клеток на популяционной и индивидуальных клеточном уровнях. В частности мы измерили совместно локализованных участков, интенсивности и популяционной размер позволяет поддержать вывод о значительной степени сохранить CD1d белка в конце endocytic отсеках человека РС в подверженности липофильных загрязнителей бензо [а] пирена (БАП)13 . Этот комбинированный клеточного и населения, анализ изображений предоставляет высокую воспроизводимость, всеобъемлющий и статистически значимые результаты CD1d-Lamp1 colocalization отношение к презентации антигена тормозится липидов.
Транскриптом БАП облученных людей DCs решительно поддержали гипотезу, что endocytic липидного обмена и CD1d endocytic людьми были нарушениями в экспозиции БАП. Чтобы проверить эту гипотезу, мы применили изображений проточной цитометрии профилирование изображения DC населения, которые окрашивали совместно с несколькими белков, включая CD1d, endocytic маркеры и маркеры DC. Наконец, совместно окрашенные клетки были статистически проанализированы продемонстрировать процент от интенсивности и районов CD1d и Lamp1 colocalization.
Protocol
Representative Results
Discussion
Функциональные подтверждения пути измененный ген является сложной задачей, из-за широко влияние генов выражения с участием нескольких путей и трудности интеграции индивидуальных и популяционной клеточной деятельности. Мы использовали визуализации проточной цитометрии специально т…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Роберт Giulitto (центр крови Hoxworth) для образцов крови человека и читает доктор Лян Niu для нормализации экспрессии генов. Мы также благодарим Грантовая поддержка от национального института окружающей среды медицинских наук (ES006096), центр экологической генетики (ГОЗ) экспериментального проекта (с.х.), Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний (AI115358) (с.х.), университет Премия Совета исследований Университета Цинциннати (с.х.) и университета из Цинциннати колледж медицины Core Укрепление финансирования (X. Z.).
Materials
| Transcriptomics | Illumina | HiSeq 2500 v4 | Illumina HiSeq system |
| ImagingStream X | Millipore | 100220 | Imaging flow cytometry |
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fisher | Total RNA extraction | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent | Total RNA QC analysis | |
| Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher | PCR, enzyme reaction | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England Biolab | PolyA RNA purification | |
| Automated SMARTer Apollo system | Takara | PolyA RNA purification | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolab | Library preparation | |
| Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | DNA purification | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher) | Thermo Fisher | Library quantification | |
| NEBNext Library Quant Kit | New England Biolab | Library quantification | |
| cBot | Illumina | Library cluster generation | |
| TruSeq SR Cluster Kit v3 – cBot – HS | Illumina | Library cluster generation | |
| HiSeq 1000 | Illumina | Sequencing | |
| TruSeq SBS Kit v3 – HS (50-cycles) | Illumina | Sequencing | |
| Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7) | Bio Legend | L243 | |
| Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5) | Bio Legend | 3.9 | |
| Brilliant violet 421 | Bio Legend | L161 | |
| PE-anti-mouse IgG2b | Bio Legend | 51.1 | |
| Alexa Fluor 647 (AF647) | Bio Legend | CD107a(H4A3) |
References
- Roche, P. A., Cresswell, P. Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells. Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).
- Huang, S., et al. MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells. The Journal of experimental medicine. 205 (5), 1201-1211 (2008).
- Nakamura, N., et al. Endosomes are specialized platforms for bacterial sensing and NOD2 signalling. Nature. 509 (7499), 240-244 (2014).
- Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. Pathways of antigen processing. Annual review of immunology. 31, 443-473 (2013).
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Zajonc, D. M., Kronenberg, M. CD1 mediated T cell recognition of glycolipids. Current opinion in structural biology. 17 (5), 521-529 (2007).
- Cox, D., et al. Determination of cellular lipids bound to human CD1d molecules. PloS one. 4 (5), e5325 (2009).
- Yuan, W., Kang, S. J., Evans, J. E., Cresswell, P. Natural lipid ligands associated with human CD1d targeted to different subcellular compartments. Journal of immunology. 182 (8), 4784-4791 (2009).
- Huang, S., et al. Discovery of deoxyceramides and diacylglycerols as CD1b scaffold lipids among diverse groove-blocking lipids of the human CD1 system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19335-19340 (2011).
- de Jong, A., et al. CD1a-autoreactive T cells recognize natural skin oils that function as headless antigens. Nature. 15 (2), 177-185 (2014).
- Trombetta, E. S., Mellman, I. Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo. Annual review of immunology. 23, 975-1028 (2005).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature reviews. Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
- Sharma, M., et al. Inhibition of endocytic lipid antigen presentation by common lipophilic environmental pollutants. Science Reports. 7 (1), 2085 (2017).
- Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of clinical microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).
- Nachamkin, I., et al. Agilent 2100 bioanalyzer for restriction fragment length polymorphism analysis of the Campylobacter jejuni flagellin gene. Journal of clinical microbiology. 39 (2), 754-757 (2001).
- Kaimal, V., Bardes, E. E., Tabar, S. C., Jegga, A. G., Aronow, B. J. ToppCluster: a multiple gene list feature analyzer for comparative enrichment clustering and network-based dissection of biological systems. Nucleic acids research. 38 (Web Server issue), W96-W102 (2010).
- Bauer-Mehren, A. Integration of genomic information with biological networks using Cytoscape). Methods in molecular biology. 1021, 37-61 (2013).
- Cline, M. S., et al. Integration of biological networks and gene expression data using Cytoscape. Nature protocols. 2 (10), 2366-2382 (2007).
- Huang, S., Moody, D. B. Donor-unrestricted T cells in the human CD1 system. Immunogenetics. 68 (8), 577-596 (2016).
- Huang, S. Targeting Innate-Like T Cells in Tuberculosis. Frontiers in immunology. 7, 594 (2016).
- Moody, D. B., Porcelli, S. A. Intracellular pathways of CD1 antigen presentation. Nature reviews. Immunology. 3 (1), 11-22 (2003).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9 (7), 676-682 (2012).
- Diard, M., et al. Stabilization of cooperative virulence by the expression of an avirulent phenotype. Nature. 494 (7437), 353-356 (2013).
- Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature. 9 (7), 697-710 (2012).
- Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophysical journal. 86 (6), 3993-4003 (2004).
