Трехмерные Organotypic культуры вестибулярных и слуховых органов чувств
Summary
Трехмерные organotypic культур мышиных utricle и улитки в оптически ясно коллагена, я гели заповедник врожденной ткани морфологии, позволяют для механической стимуляции путем регулировки матрицы жесткости и позволяют доставки генов вируса опосредованной.
Abstract
Органы чувств внутреннего уха сложны для изучения млекопитающих из-за их недоступности экспериментальных манипуляций и оптических наблюдений. Кроме того хотя существующие методы культуры позволяют пертурбаций биохимическими, эти методы не обеспечивают средства для изучения воздействия механической силы и жесткость тканей во время разработки внутреннего уха органов чувств. Здесь мы описываем метод для трехмерной organotypic культуру нетронутыми мышиных utricle и улитки, которая преодолевает эти ограничения. Техника для регулировки трехмерные матрицы жесткости, описанные здесь разрешает манипуляции упругой силы, противостоящие роста тканей. Таким образом, этот метод может использоваться для изучения роли механических сил во время разработки внутреннего уха. Кроме того культур позволяют вирус опосредованной гена доставки, которые могут быть использованы для усиления – и -из функция потерь экспериментов. Этот метод культуры сохраняет врожденной волосковых клеток и поддерживая клетки и служит в качестве потенциально превосходной альтернативой традиционной двумерной культуры вестибулярных и слуховых органов чувств.
Introduction
Изучение большинство аспектов развития млекопитающих органа была облегчена в vitro системах. Две основные методы в настоящее время используются для культуры вестибулярных органов чувств: свободно плавающего1 и сторонником2 препаратов. Оба метода позволяют исследования уязвимостей клетки волос3 и регенерации4 –1, в пробирке. Кроме того у развития роли паз5,6,7,Wnt8и эпидермального фактора роста рецепторов (EGFR)9,10 сигнальные каскады во внутреннем ухе было установлено, в частности, благодаря использованию в vitro культуры чувств эпителия. Однако клеточный рост и дифференциация находятся под контролем, не только через сигнализации, morphogens, но и через физические и механические подсказки, такие как межклеточных контактов, жесткость внеклеточного матрикса и механического растяжения или сужение. Роль таких механических раздражителей является сложной задачей для расследования в развивающихся внутреннего уха в естественных условиях. Кроме того существующие методы культуры свободного плавания и сторонником не подходят для такого исследования в пробирке. Здесь мы описываем метод для трехмерной organotypic культуры в коллагена я гелей различной жесткости. Этот метод главным образом сохраняет в естественных условиях архитектура кохлеарная и вестибулярная органов чувств и позволяет исследование воздействия механической силы на рост и дифференцировку11.
Потому что механических раздражителей, как известно для того чтобы активировать течению молекулярные события, такие как Бегемот, сигнальный путь12,13,14,15, важно иметь возможность объединить механической стимуляции с биохимических и генетических манипуляций. Описанный здесь метод культуры позволяет доставки генов вируса опосредованной и таким образом может использоваться для изучения, как механических, так и молекулярных сигналов во время внутреннего уха развития11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Молекулярных сигналов, которые mediate рост и дифференцировку в внутреннего уха во время разработки были широко изучены5,6,,78,9,10. Однако доказательства, полученные из системы утрикул…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-р A. Jacobo, д-р J. Сальви и A. Petelski за их вклад в оригинальных исследований, на котором основан этот протокол. Мы также благодарим J. Лам и W. Makmura для оказания технической помощи и животноводства. Мы признаем NIDCD обучения Грант T32 DC009975, NIDCD Грант R01DC015530, Робертсон терапевтического фонда развития и Фонд семьи Карузо для финансирования. Наконец мы признаем поддержку от Говард Хьюз медицинский институт, следователь которого является доктор Хадспет.
Materials
| #10 Surgical Blades | Miltex | 4-110 | |
| #5 Forceps | Dumont | 11252-20 | |
| 100 mm Petri dish | Sigma | P5856-500EA | |
| 250 uL large orifice pipette tips | USA Scientific | 1011-8406 | |
| 30 mm glass-bottom Petri dish | Matsunami Glass USA Corporation | D35-14-1.5-U | |
| 4 well plate | Thermo Fisher Scientific | 176740 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H7904 | |
| 60 mm Petri dish | Thermo Fisher Scientific | 123TS1 | |
| Acetic acid | Sigma | 537020 | |
| Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Anti-GFP, chicken IgY fraction | Invitrogen | A10262 | |
| Anti-Myo7A | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Anti-Sox2 Antibody (Y-17) | Santa Cruz | sc-17320 | |
| Bicinchoninic acid assay | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Thermo Fisher Scientific | C10340 | |
| Collagenase I | Gibco | 17100017 | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | |
| Fibroblast growth factor | Sigma | F5392 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Glutamine | Sigma | G8540 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| Hemocytometer | Daigger | EF16034F | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Insulin | Sigma | I3536 | |
| Iridectomy scissors | Zepf Medical Instruments | 08-1201-10 | |
| Microinjector | Narishige | IM-6 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Gibco | 70011044 | |
| PBS (1X), pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Phenol Red pH indicator | Sigma | P4633 | |
| Pure Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2716 | |
| RFP antibody | ChromoTek | 5F8 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Tabletop vortex | VWR | 97043-562 | |
| Transferrin | Sigma | T8158 | |
| Trypan blue | Sigma | T6146 |
References
- Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hear Res. 70 (1), 85-108 (1993).
- Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).
- Cunningham, L. L. The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death. Brain Res. 1091 (1), 277-281 (2006).
- Warchol, M. E., Lambert, P. R., Goldstein, B. J., Forge, A., Corwin, J. T. Regenerative proliferation in inner ear sensory epithelia from adult guinea pigs and humans. Science. 259 (5101), 1619-1622 (1993).
- Lin, V., Golub, J. S., Nguyen, T. B., Hume, C. R., Oesterle, E. C., Stone, J. S. Inhibition of Notch activity promotes nonmitotic regeneration of hair cells in the adult mouse utricles. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 31 (43), 15329-15339 (2011).
- Wu, J., et al. Co-regulation of the Notch and Wnt signaling pathways promotes supporting cell proliferation and hair cell regeneration in mouse utricles. Sci Rep. 6, 29418 (2016).
- Chai, R., et al. Wnt signaling induces proliferation of sensory precursors in the postnatal mouse cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8167-8172 (2012).
- Wang, T., et al. Lgr5+ cells regenerate hair cells via proliferation and direct transdifferentiation in damaged neonatal mouse utricle. Nat Commun. 6, 6613 (2015).
- Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme. Dev Biol. 272 (2), 432-447 (2004).
- White, P. M., Stone, J. S., Groves, A. K., Segil, N. EGFR signaling is required for regenerative proliferation in the cochlea: conservation in birds and mammals. Dev Biol. 363 (1), 191-200 (2012).
- Gnedeva, K., Jacobo, A., Salvi, J. D., Petelski, A. A., Hudspeth, A. J. Elastic force restricts growth of the murine utricle. eLife. 6, (2017).
- Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
- Dong, J., et al. Elucidation of a universal size-control mechanism in Drosophila and mammals. Cell. 130 (6), 1120-1133 (2007).
- Low, B. C., Pan, C. Q., Shivashankar, G. V., Bershadsky, A., Sudol, M., Sheetz, M. YAP/TAZ as mechanosensors and mechanotransducers in regulating organ size and tumor growth. FEBS Lett. 588 (16), 2663-2670 (2014).
- Zhao, B., et al. Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes Dev. 21 (21), 2747-2761 (2007).
- . . AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , (2013).
- Semerci, F., et al. Lunatic fringe-mediated Notch signaling regulates adult hippocampal neural stem cell maintenance. eLife. 6, (2017).
- Tuan, R. S., Lo, C. W. Developmental biology protocols. Methods in molecular biology. , 137 (2000).
- Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., May, L. A., Cunningham, L. L. Dissection of adult mouse utricle and adenovirus-mediated supporting-cell infection. J Vis Exp JoVE. (61), (2012).
- Gosset, M., Berenbaum, F., Thirion, S., Jacques, C. Primary culture and phenotyping of murine chondrocytes. Nat Protoc. 3 (8), 1253-1260 (2008).
- Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
- Burns, J. C., et al. Reinforcement of cell junctions correlates with the absence of hair cell regeneration in mammals and its occurrence in birds. J Comp Neurol. 511 (3), 396-414 (2008).
- Wang, J., et al. Regulation of polarized extension and planar cell polarity in the cochlea by the vertebrate PCP pathway. Nat Genet. 37 (9), 980-985 (2005).
- Chacon-Heszele, M. F., Ren, D., Reynolds, A. B., Chi, F., Chen, P. Regulation of cochlear convergent extension by the vertebrate planar cell polarity pathway is dependent on p120-catenin. Dev Camb Engl. 139 (5), 968-978 (2012).
- Yamamoto, N., Okano, T., Ma, X., Adelstein, R. S., Kelley, M. W. Myosin II regulates extension, growth and patterning in the mammalian cochlear duct. Dev Camb Engl. 136 (12), 1977-1986 (2009).
- Tada, M., Heisenberg, C. -. P. Convergent extension: using collective cell migration and cell intercalation to shape embryos. Dev Camb Engl. 139 (21), 3897-3904 (2012).
