Culture organotypique en trois dimensions des organes sensoriels vestibulaires et auditives
Summary
Cultures organotypique tridimensionnelle de l’utricule murin et la cochlée en défricher collagène j’ai gélifie morphologie tissulaire innée preserve optiquement, permettant une stimulation mécanique au moyen d’ajustement de la rigidité de la matrice et permettent la livraison de gène induite par le virus.
Abstract
Les organes sensoriels de l’oreille interne sont difficiles à étudier chez les mammifères en raison de leur inaccessibilité aux manipulations expérimentales et d’observation optique. En outre, bien que des techniques de culture existants permettent des perturbations biochimiques, ces méthodes ne fournissent pas un moyen d’étudier les effets de la force mécanique et la rigidité des tissus pendant le développement de l’oreille interne des organes sensoriels. Nous décrivons ici une méthode pour la culture organotypique tridimensionnelle de l’utricule murine intact et cochlée qui permet de surmonter ces limitations. La technique pour l’ajustement d’une rigidité de la matrice tridimensionnelle décrite ici permet la manipulation de la force élastique s’opposant à la croissance des tissus. Cette méthode peut donc être utilisée pour étudier le rôle des forces mécaniques au cours du développement de l’oreille interne. En outre, les cultures permettent la livraison de gène induite par le virus, qui peut être utilisée pour des expériences de gain – et perte de fonction. Cette méthode de culture préserve innée des cellules ciliées et des cellules et sert comme une alternative potentiellement supérieure à la culture traditionnelle à deux dimensions des organes sensoriels vestibulaires et auditives.
Introduction
L’étude de la plupart des aspects du développement des organes de mammifères a été facilitée par les systèmes in vitro . Deux méthodes principales sont maintenant utilisées pour la culture des organes sensoriels vestibulaires : flottant1 et adhérentes2 préparations. Les deux méthodes permettent l’étude des cellules ciliées vulnérabilités3 et régénération1,4 in vitro. En outre, le rôle du développement de l’encoche5,6, Wnt7,8et facteur de croissance épidermique receptor (EGFR)9,10 , signalisation des cascades dans l’oreille interne ont été établi, en partie, à l’aide de in vitro de cultures de l’épithélium sensoriel. Cependant, la différenciation et la croissance des cellules sont contrôlés, non seulement par le biais de signalisation par morphogènes, mais aussi par le biais de signaux physiques et mécaniques tels que des contacts intercellulaires, la rigidité de la matrice extracellulaire et mécaniques d’étirement ou constriction. Le rôle de ces stimuli mécaniques est difficile à étudier dans les pays en développement oreille interne in vivo. En outre, les méthodes actuelles de culture flottante et adhérentes ne conviennent pas pour ces études in vitro. Nous décrivons ici une méthode pour la culture organotypique tridimensionnelle en collagène I gelées de raideur variable. Cette méthode est en grande partie conserve l’architecture in vivo des organes sensoriels vestibulaires et cochléaires et permet d’étudier les effets de la force mécanique sur la croissance et la différenciation11.
Parce que les stimuli mécaniques sont connus pour activer les événements moléculaires en aval, tels que l’hippopotame signalisation voie12,13,14,15, il est important d’être capable de combiner la stimulation mécanique avec les manipulations génétiques et biochimiques. La méthode de culture décrite ici permet la livraison de gène induite par le virus et peut donc être utilisée pour étudier la signalisation mécanique et moléculaire au cours de l’oreille interne développement11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les signaux moléculaires qui médiat de la croissance et la différenciation dans l’oreille interne au cours du développement ont été étudiés intensivement5,6,7,8,9,10. Toutefois, les données obtenues dans le système utriculaire modèle suggèrent que signaux mécaniques, sentis à travers les jonctions cellulaires …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr A. Jacobo, Dr J. Salvi et A. Petelski pour leurs contributions à la recherche originale sur laquelle se fonde le présent protocole. Nous remercions également J. lamas et W. Makmura pour l’assistance technique et de l’élevage. Nous reconnaissons subvention du NIDCD formation T32 DC009975, NIDCD accorder R01DC015530, Robertson thérapeutique Development Fund et la Fondation de la famille Caruso pour financement. Enfin, nous reconnaissons le soutien du Howard Hughes Medical Institute, dont le Dr Hudspeth est un enquêteur.
Materials
| #10 Surgical Blades | Miltex | 4-110 | |
| #5 Forceps | Dumont | 11252-20 | |
| 100 mm Petri dish | Sigma | P5856-500EA | |
| 250 uL large orifice pipette tips | USA Scientific | 1011-8406 | |
| 30 mm glass-bottom Petri dish | Matsunami Glass USA Corporation | D35-14-1.5-U | |
| 4 well plate | Thermo Fisher Scientific | 176740 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H7904 | |
| 60 mm Petri dish | Thermo Fisher Scientific | 123TS1 | |
| Acetic acid | Sigma | 537020 | |
| Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Anti-GFP, chicken IgY fraction | Invitrogen | A10262 | |
| Anti-Myo7A | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Anti-Sox2 Antibody (Y-17) | Santa Cruz | sc-17320 | |
| Bicinchoninic acid assay | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Thermo Fisher Scientific | C10340 | |
| Collagenase I | Gibco | 17100017 | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | |
| Fibroblast growth factor | Sigma | F5392 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Glutamine | Sigma | G8540 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| Hemocytometer | Daigger | EF16034F | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Insulin | Sigma | I3536 | |
| Iridectomy scissors | Zepf Medical Instruments | 08-1201-10 | |
| Microinjector | Narishige | IM-6 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Gibco | 70011044 | |
| PBS (1X), pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Phenol Red pH indicator | Sigma | P4633 | |
| Pure Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2716 | |
| RFP antibody | ChromoTek | 5F8 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Tabletop vortex | VWR | 97043-562 | |
| Transferrin | Sigma | T8158 | |
| Trypan blue | Sigma | T6146 |
References
- Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hear Res. 70 (1), 85-108 (1993).
- Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).
- Cunningham, L. L. The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death. Brain Res. 1091 (1), 277-281 (2006).
- Warchol, M. E., Lambert, P. R., Goldstein, B. J., Forge, A., Corwin, J. T. Regenerative proliferation in inner ear sensory epithelia from adult guinea pigs and humans. Science. 259 (5101), 1619-1622 (1993).
- Lin, V., Golub, J. S., Nguyen, T. B., Hume, C. R., Oesterle, E. C., Stone, J. S. Inhibition of Notch activity promotes nonmitotic regeneration of hair cells in the adult mouse utricles. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 31 (43), 15329-15339 (2011).
- Wu, J., et al. Co-regulation of the Notch and Wnt signaling pathways promotes supporting cell proliferation and hair cell regeneration in mouse utricles. Sci Rep. 6, 29418 (2016).
- Chai, R., et al. Wnt signaling induces proliferation of sensory precursors in the postnatal mouse cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8167-8172 (2012).
- Wang, T., et al. Lgr5+ cells regenerate hair cells via proliferation and direct transdifferentiation in damaged neonatal mouse utricle. Nat Commun. 6, 6613 (2015).
- Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme. Dev Biol. 272 (2), 432-447 (2004).
- White, P. M., Stone, J. S., Groves, A. K., Segil, N. EGFR signaling is required for regenerative proliferation in the cochlea: conservation in birds and mammals. Dev Biol. 363 (1), 191-200 (2012).
- Gnedeva, K., Jacobo, A., Salvi, J. D., Petelski, A. A., Hudspeth, A. J. Elastic force restricts growth of the murine utricle. eLife. 6, (2017).
- Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
- Dong, J., et al. Elucidation of a universal size-control mechanism in Drosophila and mammals. Cell. 130 (6), 1120-1133 (2007).
- Low, B. C., Pan, C. Q., Shivashankar, G. V., Bershadsky, A., Sudol, M., Sheetz, M. YAP/TAZ as mechanosensors and mechanotransducers in regulating organ size and tumor growth. FEBS Lett. 588 (16), 2663-2670 (2014).
- Zhao, B., et al. Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes Dev. 21 (21), 2747-2761 (2007).
- . . AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , (2013).
- Semerci, F., et al. Lunatic fringe-mediated Notch signaling regulates adult hippocampal neural stem cell maintenance. eLife. 6, (2017).
- Tuan, R. S., Lo, C. W. Developmental biology protocols. Methods in molecular biology. , 137 (2000).
- Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., May, L. A., Cunningham, L. L. Dissection of adult mouse utricle and adenovirus-mediated supporting-cell infection. J Vis Exp JoVE. (61), (2012).
- Gosset, M., Berenbaum, F., Thirion, S., Jacques, C. Primary culture and phenotyping of murine chondrocytes. Nat Protoc. 3 (8), 1253-1260 (2008).
- Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
- Burns, J. C., et al. Reinforcement of cell junctions correlates with the absence of hair cell regeneration in mammals and its occurrence in birds. J Comp Neurol. 511 (3), 396-414 (2008).
- Wang, J., et al. Regulation of polarized extension and planar cell polarity in the cochlea by the vertebrate PCP pathway. Nat Genet. 37 (9), 980-985 (2005).
- Chacon-Heszele, M. F., Ren, D., Reynolds, A. B., Chi, F., Chen, P. Regulation of cochlear convergent extension by the vertebrate planar cell polarity pathway is dependent on p120-catenin. Dev Camb Engl. 139 (5), 968-978 (2012).
- Yamamoto, N., Okano, T., Ma, X., Adelstein, R. S., Kelley, M. W. Myosin II regulates extension, growth and patterning in the mammalian cochlear duct. Dev Camb Engl. 136 (12), 1977-1986 (2009).
- Tada, M., Heisenberg, C. -. P. Convergent extension: using collective cell migration and cell intercalation to shape embryos. Dev Camb Engl. 139 (21), 3897-3904 (2012).
