Nadiren de olsa algılama hatası düzeltildi DNA ve RNA sıralama

1. hedef DNA için sıralama hatası düzeltildi PCR güçlendirme, ilgi genomik parçacıkları. Amplicons (Malzeme tablo, madde 1) yükseltmek için bir yüksek-sadakat DNA polimeraz kullanın. PCR reaksiyon termal cycler aşağıdaki koşullarda ile yükseltmek: 30 s 98 ° c; 18-40 döngüleri 10 98 ° c, 30 s s 66 ° c ile 30 s 72 ° c; 2 dk 72 ° c; 4 ° C’de tutun PCR ürünleri paramagnetic boncuk (Malzemeler tablo, madde 2) ile arındırmak. Boncuk PCR reaksiyon bir 1: 1.8 oranı ekleyin (PCR reaksiyon birim: boncuk birim) üreticinin protokolüne göre. GKD2O. 20 µL ile elute DNA (Malzemeler tablo, madde 3) DNA’ın son konsantrasyonu belirlemek için konsantrasyon ölçmek. DNA’ın bir aliquot amplicons boyutunu onaylamak için bir % 2 özel jel (Malzemeler tablo, madde 4) çalıştırın.Not: Alternatif olarak, araştırmacılar güçlendirilmiş genomik parçaları boyutunu yanı sıra ürünlerin konsantrasyonu belirlemek için PCR ürünleri Bioanalyzer analizi yapmak için devre dışı bırakabilirsiniz. Bağdaştırıcı tavlama sıralama İ7 bağdaştırıcıları (Malzemeler tablo, Madde 5) edinin. Onlar için sonraki adımlar verilmiştir olarak kullanmak. Satın 16N i5 bağdaştırıcılarla ticari olarak aşağıdaki oligo sıralama (malzemeler tablo madde 6): AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(N1:25252525)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1) (N1) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNot: Eski yerine koymak 16N i5 bağdaştırıcıları standart i5 bağdaştırıcıları ve onlar ECS kolaylaştırmak için bir dizi 16 rastgele nükleotit bağdaştırıcılarıdır. 16N i5 bağdaştırıcısı çalışma çözüm olun: 100 µM 16N i5 bağdaştırıcısı stokunun 40 µL, 10 µL TE arabelleği ve 500 µM NaCl çözüm 10 µL. Aliquot 7.5 µL ayrı PCR kuyu içine adım 1.2.3 hazırlanan i5 çalışma çözüm. Örnek özgü i7 bağdaştırıcısının 5 µL karşılık gelen kuyu ekleyin. 95 ° c 5 min için kuluçkaya sonra her 30 1 ° C tarafından serin s 4 ° c termal cycler içinde. 4 ° C’de tutun Sonunda tamir & dA-takip kütüphanelerinNot: bağdaştırıcı tavlama ile paralel olarak bir son onarım ve dA-takip PCR amplicons adım 1.1 üzerinden gerçekleştirebilirsiniz. Bu adımların tamamlanmasını takiben, tavlanmış adım 1.2 üstüne belgili tanımlık son tamir ve PCR amplicons dA kuyruklu bağdaştırıcılarının tüp ligasyonu gerçekleştirilir. Bağdaştırıcı ligasyonu ECS Kütüphane inşaat tamamlanır. Begin ile en az 1 µg DNA başlayan (en az ~ 200 ng) Son onarım ve dA-kuyruk amplicons (Malzeme tablo, Madde 7) gerçekleştirin. Son hazırlık enzim Mix 3.0 µL ve son onarım arabelleği 6.5 µL ekleyin. Karıştırmak için 65 ° C’de 30 dk sonra için 20 ° C’de 30 dk kuluçkaya ve 4 ° C’de tutun Tüp ligasyonu tavlanmış bağdaştırıcılarında (Malzemeler tablo, madde 8) gerçekleştirin. Tavlanmış bağdaştırıcılarının 2.5 µL adım 2, Blunt/TA ligaz Mastermix 15 µL ve ligasyonu artırıcı 1 µL ekleyin. Karıştırmak sonra 37 ° C’de 15 dakika için 20 ° C’de 15 dakika için kuluçkaya Manyetik boncuklar (malzemeler tablo madde 2) kitaplıklarıyla kadar temiz: boncuk PCR reaksiyon bir tarihinde 1: 0,75 oranı ekleyin (PCR reaksiyon birim: manyetik boncuk birimi): Manyetik boncuk Çözüm 62.6 µL PCR ürünlerinin adım 1.2.7 83,5 µL içine pipet. Karışımı bir 1,5 mL düşük bağlama tüp aktarın. Yukarı ve aşağı en az 10 kez pipetting tarafından iyice karıştırın. Karışımı oda sıcaklığında 5 dakika standı bırakın. Tüp bir manyetik tutucu üzerine yerleştirin. 2 dakika oda sıcaklığında veya süpernatant kadar kuluçkaya açıktır. Süpernatant kaldırın. Boncuk 200 µL % 70 etanol ile yıkayın. 30 s. Kaldır etanol için kuluçkaya. Etanol yıkama bir kez adımları yineleyin. Boncuk kuruması. GKD2O. 20 µL ile eluteNot: Bu değişiklik PCR reaksiyon manyetik boncuk oranı tercihen 200 daha küçük olan DNA parçalarının kaldıracak bp. Miktar tarafından damlacık dijital PCRNot: Sequencer yüklenen her kitaplık moleküllerinin sayısı sıkı riayet kesin mutasyon miktar gerektirir. Bunu başarmak için birim hacim başına bireysel kitaplıkları için molekülleri sayısı miktarının QX200 damlacık dijital PCR (ddPCR) platform kullanılarak yapılır — kantitatif PCR alternatif bir seçenektir. DdPCR analizi, okuma molekülleri µL Kütüphane başına başına sayısını belirtir. ECS Kütüphaneler 1:1,000 artımlı olarak 10 PCR şerit-tüpler bir faktörle sulandrarak sulandırmak. DdPCR 1.5 mL tüp içinde aşağıdaki mastermix hazırlamak: 10 µL PCR karışımı (Malzemeler tablo, madde 9), P5 astar, P7 astar, adım 1.4.1 ECS temizlenmiş ürünün 5 µL 0.2 µL 0.2 µL. ve 4,5 µL GKD2O. İçine de 8 katları olduğundan emin yapma her örnek mastermix aliquot 20 µL. Aliquot 70 µL damlacık üretimi petrol (Malzemeler tablo, madde 10) her petrol kuyusu içine. Bir lastik conta ile kaset kapağı. Damlacık jeneratör (Malzemeler tablo, madde 11) kullanarak damlacıkları olun. Bir çok kanallı pipet ile örnek pipetting yavaş yavaş DNA kesme önlemek için 5 saniye bir span üzerinden bir PCR plaka sağlanması içine adım yapılır 1.4.4 generated damlacıkları yüklenmesi. Aşağıdaki koşullar kullanarak bir termal cycler 40 döngüleri için damlacıkları sinyal yükseltmek: 5 min 95 ° c; 30 40 döngüleri s 95 ° c, 1 dk. 63 ° c; 5 dk 4 ° c, 5 min 90 ° c; ve sonra 4 ° C’de basılı tutun DdPCR şablon damlacık okuyucu makine (Malzemeler tablo, madde 11) hazırlayın. Parametreler için belirtim Mutlak miktar ve kullanmak için emin olmak QX200 ddPCR Eva yeşil Supermix. DdPCR analiz işlemi tamamlandıktan sonra tüm örnekler üzerindeki aynı bölücü eşik ayarlamak emin olun. Konsantrasyon okuma QX200 damlacık okuyucudan aliquot moleküller için istediğiniz sayıyı içine sonraki adım tanıtmak için uygun birim kullanarak. Sıralama için kütüphanelerin PCR güçlendirme Aşağıdaki mastermix moleküller için istediğiniz sayıda adım 1.4.9 hazırlamak: Q5 Mastermix (Malzemeler tablo, madde 1), P5 astar 2.5 µL 25 µL (10 µM), 2,5 µL P7 astar (10 µM), DNA, 20-X µL GKD2O. X µL Aşağıdaki koşullar kullanarak bir termal cycler 1.5.1 adımda kitaplıklardan yükseltmek: 30 s 98 ° c; 10 20 döngüleri 98 ° c, 30 s s 63 ° c, 30 s 72 ° c; 2 dk 72 ° c; ve sonra 4 ° C’de basılı tutun Manyetik boncuklar (malzemeler tablo, madde 2) kitaplıklarıyla kadar temiz: PCR reaksiyon manyetik boncuklar değiştirilmiş bir 1: 0,75 oranı ekleyin (PCR reaksiyon birim: manyetik boncuk birim). 1.5.2. adımdaki 50 µL PCR ürünlerde manyetik boncuk çözüm 37,5 µL pipet. Karışımı bir 1,5 mL düşük bağlama tüp aktarın. Yukarı ve aşağı en az 10 kez pipetting tarafından iyice karıştırın. Karışımı oda sıcaklığında 5 min için standı bırakın. Tüp bir manyetik tutucu üzerine yerleştirin. 2 dakika oda sıcaklığında veya süpernatant kadar kuluçkaya açıktır. Süpernatant kaldırın. Boncuk 200 µL % 70 etanol ile yıkayın. 30 s. Kaldır etanol için kuluçkaya. Etanol yıkama bir kez adımları yineleyin. Boncuk kuruması. GKD2O. 20 µL ile elute DNA’ın bir aliquot amplicons boyutunu onaylamak için % 2 özel jel üzerinde çalıştırın. DNA (Malzemeler tablo, madde 3) ayrı ECS kütüphanelerin konsantrasyonu belirlemek için konsantrasyon ölçmek. Ekimolar tutarları kitaplıklarda havuz.Not: Örneğin, sekiz kitaplıklarıyla 4 milyon molekülleri ilâ 400 milyon okuma verir bir sıralama platformu kullanarak sıralama için başlayan bir ekimolar grup4 araştırmacılar havuz. Konservatif, bu hata düzeltme molekülleri başına ortalama on ham okuma kullanmak için tavsiye edilir. Bu 360 milyon okuyor alacağını (4 milyon molekülleri * 8 kitaplıkları * 10 okur hata düzeltme için). Kütüphane başına 4 milyon benzersiz molekülleri ile araştırmacılar bir teorik kötü fikir birliği 7042 x amplicon (4 milyon/568 amplicons gen panelinden) başına kapsama okumak almak için bekleyebilirsiniz. DNA (Malzemeler tablo, madde 3) havuzlu ECS kitaplığının konsantrasyonu belirlemek için konsantrasyon ölçmek. Havuza alınan ECS kütüphane yaklaşık 4’te göndermek nM. Illumina sıralama platformlara (MiSeq, HiSeq veya NextSeq) aşağıdaki sıralama ayarları sağlar: 2 x 144 eşleştirilmiş uç okur, 8 döngüleri Dizin 1 ve 16 döngüleri dizin 2. 2. Gene panelleri ile DNA’ın sıralama hatası düzeltildi Hibridizasyon oligos gen panelleriNot: Bu adımda, bir UMIs (Malzeme tablo, madde 17) dahil etmek için değiştirilmiş bir Illumina TruSight veya TruSeq protokolünü kullanarak sıralama kitaplıkları oluşturmak. Oligos üreticisinin protokol sonrası genomik parçası üzerine melez. Kullanım 250 ng DNA (veya istediğiniz herhangi bir miktarda malzeme başlayan). İlişkisiz oligos üreticisinin protokol sonrası kaldırın. Uzantısı-birleştirmesini gerçekleştirmek üreticisinin protokol sonrası.Not: Üreticinin iletişim kuralı değişiklikler aşağıda başlar. İ5 ve i7 bağdaştırıcıları PCR ile birleşme PCR mastermix uygun birim boyutu bir tüpün içine aşağıdaki reaktifler pipetting tarafından hazırlamak: 37,5 µL Q5 Mastermix (Malzemeler tablo, madde 1), 6 µL i7 bağdaştırıcıları (kullanım farklı i7 6 µL 10 µM 16N i5 bağdaştırıcıları (ayrıntılı olarak açıklandığı Yöntem 1, adım 1.2.2), bağdaştırıcılar çoğullama için ayrı örnekleri için) ve uzatma-ligasyonu çözüm adım 2.1.3 boncuk ile 22 µL.Not: Illumina tarafından sağlanan polimeraz mastermix Q5 Mastermix yerini alır. Q5 polimeraz yüksek sadakat ve daha az tanıtıldı hataları ile genomik parçası güçlendirir. Aşağıdaki parametreleri kullanarak bir termal cycler üzerinde PCR programını çalıştırın: 30 s 98 ° c, 4-6 döngüleri 10 98 ° c, 30 s s 66 ° c, 30 s 72 ° c; 2 dk 72 ° C ve 4 ° C’de sonra tutunNot: Devir sayısı panel boyutuna bağlıdır. 500-600 Çift oligos paneliyle PCR 6 döngüleri gerektirir, ancak bizim deneyim, bir 4-döngüsü PCR gen paneli gen belirli oligos, 1500 farklı çift varsa yeterli olur. PCR reaksiyonları ile manyetik boncuklar (malzemeler tablo, madde 2) kadar temiz: manyetik boncuklar PCR reaksiyon değiştirilmiş bir 1 PCR reaksiyon ekleyin: 0,75 manyetik boncuk oranı: 75 µL PCR ürünlerinin adım 2.2.2 içine manyetik boncuk çözüm 56.25 µL pipet. Karışımı bir 1,5 mL düşük bağlama tüp aktarın. Yukarı ve aşağı en az 10 kez pipetting tarafından iyice karıştırın. Karışımı oda sıcaklığında 5 min için standı bırakın. Tüp bir manyetik tutucu üzerine yerleştirin. 2 dakika oda sıcaklığında veya süpernatant kadar kuluçkaya açıktır. Süpernatant kaldırın. Boncuk 200 µL % 70 etanol ile yıkayın. 30 s. Kaldır etanol için kuluçkaya. Etanol yıkama bir kez adımları yineleyin. Boncuk kuruması. GKD2O. 20 µL ile elute Kütüphaneler QX200 ddPCR platformu kullanarak ölçmek. Yöntem 1. adımda 1.4 izleyin.Not: 4 milyon molekülleri örnek kütüphane4 temsilcisi sonuç (Şekil 2) başına 7,042 benzersiz olarak dizili molekülleri (4 milyon 568 gene özgü oligos tarafından bölünmüş) teorik ortalaması elde etmek için normalleştirilmiş. Sıralama için kitaplıklarına normalleştirmek ve yükseltmek. Aşağıdaki mastermix 50 µL toplam son PCR için kullanarak moleküller için istediğiniz sayıyı yükseltmek: Q5 Mastermix, P5 astar 2 µL 25 µL (1 µM), 2 µL P7 astar (1 µM) ve DNA moleküllerinin 21 µL. PCR programı aşağıdaki parametresini kullanarak bir termal cycler üzerinde Çalıştır: 30 s 98 ° c; 10 16 döngüleri 98 ° c, 30 s s 66 ° c, 30 s 72 ° c; 2 dk 72 ° c; ve sonra 4 ° C’de basılı tutun Yukarı temiz manyetik boncuklar (Malzemeler tablo, madde 2) kullanarak sıralama kütüphaneler: PCR reaksiyon manyetik boncuklar için değiştirilmiş bir 1 PCR reaksiyon ekleyin: 0,75 manyetik boncuk oranı: 2.4.2. adımdaki 50 µL PCR ürünlerde manyetik boncuk çözüm 37,5 µL pipet. Karışımı bir 1,5 mL düşük bağlama tüp aktarın. Yukarı ve aşağı en az 10 kez pipetting tarafından iyice karıştırın. Karışımı oda sıcaklığında 5 min için standı bırakın. Tüp bir manyetik tutucu üzerine yerleştirin. 2 dakika oda sıcaklığında veya süpernatant kadar kuluçkaya açıktır. Süpernatant kaldırın. Boncuk 200 µL % 70 etanol ile yıkayın. 30 s. Kaldır etanol için kuluçkaya. Etanol yıkama bir kez adımları yineleyin. Boncuk kuruması. GKD2O. 20 µL ile elute Bir aliquot eluted DNA’ın çalıştırmak (~ 3 µL) amplicons boyutunu onaylamak için % 2 özel jel üzerinde. DNA (Malzemeler tablo, madde 3) ayrı ECS kütüphanelerin konsantrasyonu belirlemek için konsantrasyon ölçmek. Ekimolar tutarları kitaplıklarda havuz. 1.5.6 Yöntem 1 adıma bakın. ve ayrıca tartışma havuzu oluşturma hakkında daha fazla bilgi. Havuza alınan ECS kütüphane yaklaşık 4’te göndermek nM. Illumina sıralama platformlara (MiSeq, HiSeq veya NextSeq) aşağıdaki sıralama ayarları sağlar: 2 x 144 eşleştirilmiş uç okur, 8 döngüleri Dizin 1 ve 16 döngüleri dizin 2. ECS Bioinformatic işleme ve analiz Örnek demultiplexed okuma Sequencer’ı elde etmek veya i7 bağdaştırıcısı dizileri bioinformatically ile özel bir komut dosyası kullanarak farklı örnekleri içine çiğ sıra okur sayısı azaltma gerçekleştirir. Oligo dizileri gene panelinden kaldırmak için demultiplexed her okuma ilk 30 nükleotit kapalı döşeme. Okuma aileler oluşturmak için aynı UMIs bir başka paylaşmak okuma hizalayın.Not: Araştırmacılar MAGERI13 gibi UMI kullanan yazılımlar okuma aileler ayıklamak için kullanabilirsiniz. Hamming hiçbir mesafe bu deneyde UMI dizisi içinde yöntemi özgüllüğü artırmak için izin verildi. De-çoğaltma ve hata düzeltme aşağıda önerilen parametreleri kullanarak gerçekleştirin. Kullanım ≥5 çiftler halinde aynı aile okuyun okuyun. En az üç okuma çift önerilir. Nükleotit her pozisyonda aynı okuma ailesindeki tüm okuma arasında karşılaştırmak ve en az % 90 bir fikir birliği nükleotit oluşturmak için belirli nükleotit okuma arasında uyumluluk. % 90’ı anlaşma daha az bir varsa N nükleotit pozisyon için ara. Var fikir birliği okuma atmak > N. çağrıldığını fikir birliği nükleotit sayısı yüzde 10’u Tüm muhafaza fikir birliği okuma araştırmacı tercih edilen aligner(s) Bowtie2 ve BWA gibi kullanarak yerel olarak hg19 ya da hg38 insan başvuru genom için hizalayın. İşlem parametrelerini kullanarak Mpileup ile okuma hizalı – BQ0 – d uygun zincirleme kaza çıktı VAF ne olursa olsun emin olmak için kapsama eşikleri kaldırmak için 10,000,000,000,000. Pozisyonları kapsama okumak az 1000 x fikir birliği ile filtre.Not: Araştırmacı her nükleotit pozisyon için asgari sigorta kapsamı keyfi belirler, bu en az 500 x uzlaşma kapsamı aşağı akım analizi için okumak için tavsiye edilir. Binom dağılımı tek nükleotid türevleri (SNPs) aramak için adım 2.5.7 aşağıdaki parametrelerle tutulan verileri kullanın. Binom hayatinizda genomik pozisyon özgü hata modeli üzerinde temel alır. Genomik her pozisyon bağımsız olarak dışarı hata oranları belirli pozisyon için tüm örneklerin özetleme sonra modellenmiştir. Aşağıdaki örnekte:Olasılık nükleotit profilinin belirli bir genomik pozisyonda, p∑ Varyant RF2 ∑ toplam RFs26/255505 =0.000101759 =Binom olasılığı 24 varyantın RFs 35911 toplam RFs, Pdışında (X ≥ x) örnek K1 – binomial(24, 35911, 0.000101759) =2.26485E =-13Not: genomik her pozisyon için sorgulanan olurdu üç olası mutational değişiklikler (Örneğin,A > T, A > C, A > G), ve her biri arka plan yapısı olarak temsil edilir. Bonferroni düzeltme sonra arka plandan farklı somatik olaylar korunur. Tablo 1′ de gösterilen örnekte, yapılan testler sayısı 11, dolayısıyla düzeltilmiş bir Bonferroni p-değeri ≤0.00454545 (0,05/11) bir olay olarak istatistiksel olarak önemli aramak için gerekli oldu. Somatik olayları her iki çoğaltır aynı örnek bulunması için gerekli olan; Aksi takdirde, onları yanlış pozitif görür. Tablo 1: pozisyon özgü binom hata modeli oluşturmak için yol gösteren örnek. 3. hata düzeltilmiş sıralama RNA’ın Mutasyonlar DNA düzeyinde değerlendirilmesi yanı sıra, ECS nadir veya düşük bereket transkript RNA düzeyinde tespit etmek için çeşitli hedeflenen RNA sıralama panelleri ile entegre. ECS kapalı QIAGEN RNA sıralama panelleri ile birleştirerek, tutanaklar ile normalleştirme temizlik gen karşı gerek olmadan on kopya olarak az gen ifade dijital miktar gösterdi. Hata düzeltme için gerekli UMIs paneline entegre edilmiştir. Toplam RNA ayıklama (Malzemeler tablo, öğe 20) gerçekleştirin. ECS-RNA Kütüphane hazırlık üreticisinin Protokolü (Malzemeler tablo, madde 19) göre yerine getirir. Biyoinformatik boru hattı adım 2.5.1–2.5.6 göre gerçekleştirin. Yöntem 2 önceki bölümde özetlenen. 2.5.6 adımdan sonra gene başına hizalanmış fikir birliği okuma sayısı gen uzunluğu normalleştirme için gerek kalmadan gen ifade düzeyini temsil eder.