エラー修正 DNA ・ RNA シーケンスを用いた珍しいイベント検出

1. ターゲット dna シーケンスのエラー修正 興味のゲノム断片の PCR の拡大。 (材料表項目 1) amplicons を増幅するのに高忠実度 DNA ポリメラーゼを使用します。サーマルサイクラーに以下の条件で PCR 反応を増幅する: 30 98 ° c; s10 の 18-40 のサイクル 98 ° c、30 秒 66 ° c、s と 30 s 72 ° c;72 ° C で 2 分4 ° C で保持します。 常磁性ビーズ (材料表項目 2) PCR の製品を浄化します。1: 1.8 インチ比でビーズに PCR 反応を追加 (PCR の反作用ボリューム: ボリュームをビーズ) 製造元のプロトコルに従って。DdH2o. の 20 μ L の溶出します。 (材料表項目 3) DNA の最終濃度を決定する DNA の濃度を定量化します。 2% アガロース ゲル (材料表アイテム 4)、産物のサイズを確認するための DNA の因数を実行します。注: 代わりに、研究者は、増幅されたゲノム断片のサイズだけでなく、製品の濃度を決定する PCR の製品のバイオアナライザー分析を実行を選択できます。 アダプター熱処理シーケンス I7 アダプター (材料表項目 5) を取得します。以降の手順のためのものです、それらを使用します。 次の oligo シーケンス (材料表の項目 6) と商業的 16N i5 アダプターを購入: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(N1:25252525)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1) (N1) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTメモ: 16N i5 アダプター交換標準 i5 アダプター、ECS を容易にするために 16 のランダムな塩基配列の文字列でアダプターです。 16N i5 アダプター実用的なソリューションを作る: 100 μ M 16N i5 アダプター在庫 40 μ、10 μ L TE バッファーの 500 μ M の塩化ナトリウム溶液 10 μ L。 個別 PCR 井戸に 1.2.3 のステップで、i5 作業溶液の分注 7.5 μ。 対応する井戸にサンプル固有 i7 アダプターの 5 μ L を追加します。 95 ° C、5 分インキュベートし、すべての 30 の 1 ° C でクールなサーマルサイクラーに 4 ° C に s。 4 ° C で保持します。 最後修理 & ライブラリの dA テーリング注: でアダプターがアニール処理と並行して、1 つに対して実行できます最後の修理や dA テーリング手順 1.1 から PCR 産物。これらの手順が完了した後、修理終了と PCR 産物の dA 尾にステップ 1.2 から焼鈍のアダプターの ligation が実行されます。次のアダプターの ligation ECS ライブラリーの構築は完了です。 せいぜい 1 μ g の DNA を開始始まる (最小 ~ 200 ng) Amplicons (材料表項目 7) で終了-修理および dA 尾を実行します。 終了準備酵素ミックス 3.0 μ と終わり修理バッファーの 6.5 μ L を追加します。 ミックス 65 ° C で 30 分間、20 の ° C で 30 分間インキュベートし、4 ° C で保持 焼なましアダプター (材料表項目 8) で結紮を実行します。 ステップ 2、鈍/TA リガーゼ マスター ミックスの 15 μ L、結紮エンハンサーの 1 μ L から焼鈍アダプターの 2.5 μ L を追加します。 37 ° C で 15 分間、20 の ° C で 15 分間のミックスを孵化させなさい 磁気ビーズ (材料表項目 2) ライブラリのクリーンアップ: 修正 1: 0.75 の比率でビーズに PCR 反応を追加 (PCR の反作用ボリューム: 磁気ビーズ容積)。 1.2.7 のステップからの PCR の製品の 83.5 μ L に磁気ビーズ ソリューションの 62.6 μ L をピペットします。 1.5 mL 低バインド チューブに混合物を転送します。 10 回以上でピペッティングを上下で徹底的にミックスします。 5 分間室温で放置に混合物を残します。 マグネット ホルダーにチューブを置きます。室温でまたは清まで 2 分間インキュベートは明らか。 上清を除去します。 70% エタノール 200 μ L でビーズを洗浄します。 30 s. 削除エタノール間インキュベートします。 エタノールの洗浄ステップをもう一度繰り返します。 ビーズを風乾します。 DdH2o. の 20 μ L の溶出します。注: 磁気ビーズ比 PCR の反作用のこの変更は、200 より小さい DNA のフラグメントが削除されます優先的に bp。 液滴による定量化デジタル PCR注: 正確な突然変異定量化シーケンサーに読み込まれた各ライブラリの分子の数の厳守が必要です。これを達成するため、個々 のライブラリ単位体積あたりの分子数を定量化は実行 QX200 液滴デジタル PCR (ddPCR) プラットフォームを使用して-量的な PCR は、代替オプションです。DdPCR 分析、次の読み出しはライブラリごと μ L あたりの分子の数を指定します。 PCR ストリップ管の 10 倍段階希釈して ECS ライブラリ縮尺を希釈します。 1.5 mL チューブに ddPCR の次のマスター ミックスを準備: 10 μ L の PCR ミックス (材料表項目 9)、プライマー P5、P7 プライマー、ステップ 1.4.1 から ECS クリーンアップ製品の 5 μ L の 0.2 μ L の 0.2 μ L、と 4.5 μ ddH2o.。 それぞれにマスター ミックスの 20 μ L 分注のサンプルも 8 の倍数があることを確かめます。 分注 70 μ L 各油井に液滴生成油 (材料表、項目 10)。ゴム製のガスケットとカセットをカバーします。 液滴の液滴形成配列装置 (材料表、項目 11) を使用してください。 マルチ チャンネル ピペットを使用して、確保する PCR プレートに DNA をせん断を避けるために 5 秒のスパンでゆっくりと行われるサンプル分注ステップ 1.4.4 で生成された液滴をロードします。 次の条件を使用して熱 cycler で 40 サイクルの液滴に信号を増幅する: 95 ° C、5 分30 の 40 のサイクル 95 ° C、63 ° C で 1 分で s4 ° C、90 ° C で 5 分間で 5 分4 ° C で押し DdPCR テンプレート液滴リーダー マシン (材料表、項目 11) を準備します。絶対定量および使用するためのパラメーター指定ください、 QX200 ddPCR エバー グリーン スーパーミックス。 DdPCR 分析が完了すると、すべてのサンプルの間で同じの不和を生じるしきい値を設定するを確認してください。 QX200 液滴リーダー、因数後続の手順に必要な分子数を導入する適切なボリュームから濃度読み出しを使用しています。 シーケンス処理用ライブラリの PCR の拡大 1.4.9 のステップから分子の所望の数の次のマスター ミックスの準備: Q5 マスター ミックス (材料表項目 1) P5 プライマーの 2.5 μ L を 25 μ l 添加 (10 μ M)、P7 プライマーの 2.5 μ L (10 μ M)、dna の ddH2o. の 20 X μ L X µL 次の条件を使用してサーマルサイクラーのステップ 1.5.1 からライブラリを増幅する: 30 98 ° c; s10 の 20 サイクル 98 ° c、30 秒 63 ° c、30 s 72 ° c; s72 ° C で 2 分4 ° C で押し 磁気ビーズ (材料表、項目 2) ライブラリのクリーンアップ: 磁気に PCR の反作用は 1: 0.75 比変更されるのビーズを追加 (PCR の反作用ボリューム: 磁気ビーズ ボリューム)。 磁気ビーズ ソリューションの 37.5 μ L のピペット ステップ 1.5.2 から 50 μ L の PCR の製品に。 1.5 mL 低バインド チューブに混合物を転送します。 10 回以上でピペッティングを上下で徹底的にミックスします。 5 分間室温で放置に混合物を残します。 マグネット ホルダーにチューブを置きます。室温でまたは清まで 2 分間インキュベートは明らか。 上清を除去します。 70% エタノール 200 μ L でビーズを洗浄します。 30 s. 削除エタノール間インキュベートします。 エタノールの洗浄ステップをもう一度繰り返します。 ビーズを風乾します。 DdH2o. の 20 μ L の溶出します。 産物のサイズを確認するため 2% の agarose のゲルの DNA の因数を実行します。 (材料表項目 3) 別々 の ECS ライブラリの濃度を決定する DNA の濃度を定量化します。 等モル量でライブラリをプールします。注: たとえば、研究者をプールできます 400 万開始まで 4 億読み取りを出力シーケンス プラットフォームを使用して配列の分子のモルのグループ4の 8 つのライブラリ。保守的、分子あたりのエラー訂正のための 10 の raw 読み取りの平均を使用することをお勧めします。これは 3 億 6000 万ヒットを取るだろう (400 万分子 * 8 ライブラリ * 10 読み取りエラー訂正のため)。ライブラリあたり 400 万ユニークな分子増幅 (遺伝子パネルから 400 万/568 amplicons) あたり 7042 x の報道を読む理論的な平均のコンセンサスを得るために研究者が期待できます。 (材料表項目 3) プールの ECS ライブラリの濃度を決定する DNA の濃度を定量化します。 約 4 でプールされた ECS ライブラリを提出 nM。 イルミナ シーケンス プラットフォーム (MiSeq、HiSeq または NextSeq) 次のシーケンス設定を提供する: 2 x 144 ペアエンドを読み取り、8 サイクル インデックス 1 と 16 サイクル インデックス 2。 2. 遺伝子 DNA のシーケンスをエラー修正パネル 遺伝子パネルから oligos の交配注: この手順で Umi (材料表、項目 17) を組み込むイルミナ TruSight または TruSeq の修正されたプロトコルを使用してシーケンス ライブラリの構築が一つ。 ゲノム フラグメント製造元のプロトコルを次に oligos を交配させます。DNA (または開始材料の任意の希望の金額) の使用 250 ng。 非連結 oligos 次の製造元のプロトコルを削除します。 拡張子結紮を行う次の製造元のプロトコル。注: 以下製造元のプロトコルへの変更を開始します。 PCR によって i5 および i7 のアダプターの組み込み 適切なボリューム サイズのチューブに以下の試薬を分注して PCR マスター ミックスを準備: Q5 マスター ミックス (材料表項目 1)、6 μ 10 μ M 16N i5 アダプター (で詳細な方法 1、ステップ 1.2.2) i7 アダプター (使用異なる i7 の 6 μ L の 37.5 μ L多重の個別サンプルのアダプター)、およびステップ 2.1.3 のビーズを使った拡張結紮ソリューションの 22 μ L。メモ: Q5 マスター ミックスは、イルミナによって提供されるポリメラーゼのマスター ミックスを置き換えられます。Q5 ポリメラーゼは、高い再現性と導入エラーを減らすゲノム断片を増幅させます。 次のパラメーターを使用してサーマルサイクラー PCR プログラムを実行: 30 s 98 ° C で、10 の 4-6 サイクル 98 ° c、30 秒 66 ° c、30 s 72 ° c; s72 ° C および 4 ° C で、保留で 2 分注: サイクルの数はパネルの大きさに依存します。500-600 組 oligos のパネルに PCR の 6 サイクルが必要ですが私たちの経験から 4 サイクルの PCR で遺伝子パネル遺伝子特定 oligos の約 1,500 の別のペアを持っている場合は十分です。 (材料表、項目 2) 磁気ビーズの PCR の反作用のクリーンアップ: 修正された 1 PCR の反作用の磁性ビーズに PCR 反応を追加: 0.75 磁気ビーズ比。 2.2.2 のステップからの PCR の製品の 75 μ L に磁気ビーズ ソリューションの 56.25 μ L をピペットします。 1.5 mL 低バインド チューブに混合物を転送します。 10 回以上でピペッティングを上下で徹底的にミックスします。 5 分間室温で放置に混合物を残します。 マグネット ホルダーにチューブを置きます。室温でまたは清まで 2 分間インキュベートは明らか。 上清を除去します。 70% エタノール 200 μ L でビーズを洗浄します。 30 s. 削除エタノール間インキュベートします。 エタノールの洗浄ステップをもう一度繰り返します。 ビーズを風乾します。 DdH2o. の 20 μ L の溶出します。 QX200 ddPCR プラットフォームを使用してライブラリを定量化します。 方法 1 で手順 1.4。注: 400 万分子サンプル ライブラリ4代表的な結果 (図 2) にあたり 7,042 固有インデックス化された分子 (400 万 568 遺伝子特定 oligos で割った値) の理論的な平均値を得るために正規化されました。 増幅し、シーケンス処理用ライブラリを正規化します。 必要な合計 50 μ L 最終的な PCR のための次のマスター ミックスを用いた分子数を増幅する: Q5 マスター ミックス、P5 のプライマーの 2 μ L の 25 μ L (1 μ M)、P7 プライマーの 2 μ L (1 μ M) と 21 μ L の DNA 分子の。 次のパラメーターを使用してサーマルサイクラー PCR プログラムを実行: 30 98 ° c; s10 の 16 サイクル 98 ° c、30 秒 66 ° c、30 s 72 ° c; s72 ° C で 2 分4 ° C で押し (材料表項目 2) 磁気ビーズを用いたシーケンス ライブラリのクリーンアップ: 修正された 1 PCR の反作用の磁性ビーズに PCR 反応を追加: 0.75 磁気ビーズ比。 2.4.2 のステップから 50 μ L の PCR の製品に磁気ビーズ ソリューションの 37.5 μ L をピペットします。 1.5 mL 低バインド チューブに混合物を転送します。 10 回以上でピペッティングを上下で徹底的にミックスします。 5 分間室温で放置に混合物を残します。 マグネット ホルダーにチューブを置きます。室温でまたは清まで 2 分間インキュベートは明らか。 上清を除去します。 70% エタノール 200 μ L でビーズを洗浄します。 30 s. 削除エタノール間インキュベートします。 エタノールの洗浄ステップをもう一度繰り返します。 ビーズを風乾します。 DdH2o. の 20 μ L の溶出します。 溶離された DNA の因数を実行 (〜 3 μ L) 2% の agarose ゲル、産物のサイズを確認します。 (材料表項目 3) 別々 の ECS ライブラリの濃度を決定する DNA の濃度を定量化します。 等モル量でライブラリをプールします。方法 1 の手順 1.5.6 を参照してください。プーリングの詳細についても議論。 約 4 でプールされた ECS ライブラリを提出 nM。 イルミナ シーケンス プラットフォーム (MiSeq、HiSeq または NextSeq) 次のシーケンス設定を提供する: 2 x 144 ペアエンドを読み取り、8 サイクル インデックス 1 と 16 サイクル インデックス 2。 ECS バイオ情報処理・解析 シーケンサーからサンプルにデマルチプレックスした読み取りを取得したり、カスタム スクリプトで i7 アダプター シーケンス bioinformatically を使用してさまざまなサンプルに塩基配列読み取りの逆多重化を行います。 遺伝子パネルからオリゴのシーケンスを削除する各デマルチプレクスされた読み取りの最初 30 ヌクレオチドを切り落とします。 読み取りの家族を形成する互いに同じ行政を共有読み取りを合わせます。メモ: 読み取り家族を抽出する MAGERI13など海対応ソフトウェアは、研究者が使用できます。法の特異性を高めるため、この実験で海シーケンス内のハミング距離は許可されません。 重複およびエラー訂正次のパラメーターを使用して実行します。 使用 ≥5 読む同じペアの家族。読み取りの 3 つのペアの最小値をお勧めします。 同じ読み取りファミリのすべての読み取りの間であらゆる位置にある塩基配列を比較し、コンセンサス塩基を生成する 90% 以上がある場合特定の塩基配列を読み取るの一致。塩基位置の 90% の契約より小さい N がある場合を呼び出します。 持っているコンセンサス読み取りを破棄 > (名) と呼ばれているコンセンサス塩基数の合計の 10% Hg19 または hg38 のいずれかの人間の参照ゲノム Bowtie2、BWA など研究者の最寄りの aligner(s) を使用してローカルにすべての保有コンセンサス読み取りを合わせます。 プロセス パラメーターを使用して Mpileup の読み取りを揃えます-BQ0-d エンに関係なく適切な玉突き事故出力を確保するカバレッジしきい値を削除する 10,000,000,000,000。 1000 未満 x 合意報道を読むと位置を除外します。メモ: 研究者は任意各ヌクレオチドの位置の最小範囲を決定、勧め下流解析のための報道を読む、少なくとも 500 x コンセンサスを持っています。 二項分布を使用して、次のパラメーターでステップ 2.5.7 から保有データの単一のヌクレオチドの亜種 (SNPs) を呼び出します。二項分布の統計は、ゲノムの位置固有のエラー モデルに基づいているが。その特定の位置のためのすべてのサンプルのエラー率を加算した後、それぞれのゲノム位置は独立してモデル化します。次の例。所定ゲノムの位置、 pにヌクレオチド プロファイルの確率∑ バリアント RF2 σ 合計 RFs= 26/255505= 0.00010175924 バリアント 35911 合計 RFs、 Pから RFs の二項確率 (X ≥ x) サンプル K1-binomial(24, 35911, 0.000101759) を == 2.26485E-13注: 照会各ゲノムの位置にある 3 つの可能な変異 (すなわち、A > T、A > C、A > G) とそれぞれの背景の成果物として表現されます。ボンフェローニ補正後背景と異なっている体細胞のイベントが保持されます。表 1に示す例では、実行したテストの数が 11、それ故、ボンフェローニ修正p-≤0.00454545 の値 (0.05/11) 重要な統計としてイベントを呼び出すために必要だった。 体細胞イベントが同じ標本; から両方のレプリケートに存在する必要があります。そうしないと、誤検知として考えてください。 表 1: この例位置特異的二項誤差モデルを構築する方法を示します。 3 エラー訂正 RNA の塩基配列決定 DNA レベルでの突然変異の評価に加えて RNA レベルで稀または低豊富なトラン スクリプトを検出する様々 なターゲット RNA シーケンス パネルと ECS を統合します。市販の Qiagen RNA シーケンス パネルと ECS を組み合わせて、ハウスキーピング遺伝子に対する正規化を必要とせず 10 冊ほど成績の遺伝子発現の定量を行った。エラー訂正のために必要な行政は、パネルに統合されています。 総 RNA の抽出 (材料表、アイテム 20) を実行します。 製造元のプロトコル (材料表、項目 19) によると ECS RNA ライブラリの準備を行います。 ステップ 2.5.1–2.5.6 によるとバイオインフォマティクス パイプラインを実行します。前のセクションで説明されているメソッド 2。2.5.6 のステップの後は、遺伝子ごとの一直線に並べられたコンセンサス読み取りの数は遺伝子の長さの正規化を必要とせず遺伝子の発現レベルを表します。