Rilevamento di eventi rari utilizzando la sequenza di RNA e DNA di correzione d'errore

1. mirati correzione d’errore di sequenziamento del DNA Amplificazione di PCR dei frammenti genomic di interesse. Utilizzare una DNA polimerasi ad alta fedeltà per amplificare gli ampliconi (Tabella materiali, pos. 1). Amplificare la reazione di PCR con i seguenti termini in un termociclatore: 30 s a 98 ° C; 18 – 40 cicli di 10 s a 98 ° C, 30 s a 66 ° C e 30 s a 72 ° C; 2 min a 72 ° C; tenere a 4 ° C. Purificare i prodotti di PCR con perline paramagnetici (Tabella materiali, pos. 2). Aggiungere la reazione di PCR per le perle in un rapporto di 1: 1.8 (volume di reazione di PCR: volume del branello) secondo il protocollo del produttore. Eluire con 20 µ l di ddH2O. Quantificare la concentrazione di DNA (Tabella materiali, pos. 3) per determinare la concentrazione finale del DNA. Eseguire un’aliquota del DNA su gel di agarosio 2% (Tabella materiali, pos. 4) per confermare la dimensione degli ampliconi.Nota: In alternativa, i ricercatori possono scegliere di eseguire un’analisi Bioanalyzer sui prodotti di PCR per determinare la dimensione dei frammenti genomic amplificati nonché la concentrazione dei prodotti. Sequenziamento adattatore ricottura Ottenere delle schede di i7 (Tabella materiali, pos. 5). Li usano come sono previste per i passaggi successivi. Acquistare gli adattatori i5 16N commercialmente con la seguente sequenza di oligo (tabella materiali pos. 6): ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(N1:25252525)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1) (N1)Nota: Le schede di i5 16N sostituire le schede standard i5 e sono adattatori con una stringa di 16 casuale-nucleotide per facilitare ECS. Rendere la soluzione di lavoro di 16N i5 adattatore: 40 µ l di Stock in adattatore di 100 µM 16N i5, 10 µ l di buffer di TE e 10 µ l di soluzione di NaCl 500 µM. Aliquotare 7,5 µ l di soluzione di lavoro di i5 preparata al punto 1.2.3 in pozzetti separati di PCR. Aggiungere 5 µ l di campione specifico i7 adattatore nei pozzetti corrispondenti. Incubare a 95 ° C per 5 min poi raffreddare di 1 ° C ogni 30 s a 4 ° C in un termociclatore. Tenere a 4 ° C. Fine-riparazione & dA-tailing delle bibliotecheNota: In parallelo con adattatore ricottura, uno può eseguire fine riparazione e dA-tailing sugli ampliconi PCR di passaggio 1.1. Dopo il completamento di questi passaggi, viene eseguita la legatura degli adattatori ricotti da passo 1.2 sul fine riparato e dalla coda dA ampliconi PCR. Dopo la legatura adattatore, la costruzione della libreria ECS è completa. Iniziano con al massimo 1 µ g di DNA di partenza (minimo ~ 200 ng) Eseguire fine-riparazione e dA-coda ampliconi (Tabella materiali, pos. 7). Aggiungere 3,0 µ l di fine preparazione enzima Mix e 6,5 µ l di tampone di riparazione di fine. Incubare la miscela per 30 min a 20 ° C, poi per 30 min a 65 ° C con permanenza a 4 ° C. Eseguire la legatura sugli adattatori ricotti (Tabella materiali, punto 8). Aggiungere 2,5 µ l delle schede ricotte dal passaggio 2, 15 µ l di Blunt/TA ligasi Mastermix e 1 µ l di potenziatore della legatura. Incubare il mix per 15 min a 20 ° C, poi per 15 min a 37 ° C. Ripulire le librerie con biglie magnetiche (tabella materiali pos. 2): aggiungere la reazione di PCR per perline in un rapporto di 1: 0.75 modificate (volume di reazione di PCR: volume di biglie magnetiche): Pipettare 62,6 µ l di soluzione di biglie magnetiche nell’83,5 µ l di prodotti di PCR dal punto 1.2.7. Trasferire il composto in una provetta di associazione basso da 1,5 mL. Mescolare accuratamente pipettando su e giù almeno 10 volte. Lasciare l’impasto a riposare a temperatura ambiente per 5 minuti. Posizionare il tubo su un supporto magnetico. Incubare per 2 minuti a temperatura ambiente o fino a quando il surnatante è chiaro. Rimuovere il surnatante. Lavare le perle con 200 µ l di etanolo al 70%. Incubare per 30 s. Rimuovi etanolo. Ripetere il passaggio di lavaggio di etanolo una volta. Asciugare le perline. Eluire con 20 µ l di ddH2O.Nota: Questa modifica nella reazione di PCR al rapporto di biglie magnetiche preferenzialmente rimuoverà i frammenti di DNA che sono minori di 200 bp. Quantificazione di gocciolina PCR digitaleNota: Quantificazione precisa mutazione richiede la stretta osservanza del numero di molecole di ogni libreria che sono caricate sul sequencer. Per raggiungere questo obiettivo, quantificare il numero di molecole per singole librerie per unità di volume viene eseguita utilizzando la piattaforma PCR (ddPCR) QX200 digitale gocciolina — PCR quantitativa è un’opzione alternativa. A seguito di analisi di ddPCR, la lettura specifica il numero di molecole per µ l in ogni libreria. Diluire 1:1,000 librerie ECS diluendo in modo incrementale di un fattore 10 in striscia-provette per PCR. Preparare la seguente mastermix per ddPCR in provetta da 1,5 mL: 10 µ l di miscela di PCR (Tabella materiali, punto 9), 0,2 µ l di Primer P5, 0,2 µ l di Primer P7, 5 µ l di prodotto ripulito ECS dal punto 1.4.1. e 4,5 µ l di ddH2O. Aliquotare e 20 µ l di mastermix in ciascun campione Bene assicurandosi che non ci sono multipli di 8. Aliquotare e 70 µ l di olio di generazione di goccia (Tabella materiali, pos. 10) in ogni pozzetto di olio. Coprire la cassetta con una guarnizione in gomma. Rendere le goccioline utilizzando il generatore di goccia (Tabella materiali, elemento 11). Usando una pipetta multicanale, caricare le goccioline generate nel passaggio 1.4.4 in una piastra PCR a far sì che il pipettaggio del campione avviene lentamente nell’arco di 5 secondi per evitare il DNA di taglio. Amplificare il segnale nelle gocce per 40 cicli in un termociclatore usando le seguenti condizioni: 5 min a 95 ° C; 40 cicli di 30 s a 95 ° C, 1 min a 63 ° C; 5 min a 4 ° C, 5 min a 90 ° C; quindi tenere a 4 ° C. Preparare ddPCR modello goccia lettore macchina (Tabella materiali, elemento 11). Garantire la specifica per i parametri per la Quantificazione assoluta e utilizzando il QX200 ddPCR Eva Green Supermix. Una volta completata ddPCR analisi, assicurarsi di impostare la stessa soglia che divide attraverso tutti i campioni. Tramite la lettura di concentrazione dal lettore di goccia QX200, aliquotare il volume appropriato per introdurre il numero desiderato di molecole nel passaggio successivo. Amplificazione di PCR delle librerie per il sequenziamento Preparare il mastermix seguente per il numero desiderato di molecole dal punto 1.4.9: 25 µ l di Q5 Mastermix (Tabella materialipos. 1), 2,5 µ l di Primer P5 (10 µM), 2,5 µ l di Primer P7 (10 µM), X µL del DNA, X 20 µ l di ddH2O. Amplificare le librerie dal punto 1.5.1 in un termociclatore usando le seguenti condizioni: 30 s a 98 ° C; 20 cicli di 10 s a 98 ° C, 30 s a 63 ° C, 30 s a 72 ° C; 2 min a 72 ° C; quindi tenere a 4 ° C. Ripulire le librerie con biglie magnetiche (tabella materiali, pos. 2): aggiungere la reazione di PCR per magnetico perline in un modificato rapporto di 1: 0.75 (volume di reazione di PCR: volume di biglie magnetiche). Pipettare 37,5 µ l di soluzione di biglie magnetiche nei prodotti di PCR 50 µ l dal punto 1.5.2. Trasferire il composto in una provetta di associazione basso da 1,5 mL. Mescolare accuratamente pipettando su e giù almeno 10 volte. Lasciare l’impasto a riposare a temperatura ambiente per 5 min. Posizionare il tubo su un supporto magnetico. Incubare per 2 minuti a temperatura ambiente o fino a quando il surnatante è chiaro. Rimuovere il surnatante. Lavare le perle con 200 µ l di etanolo al 70%. Incubare per 30 s. Rimuovi etanolo. Ripetere il passaggio di lavaggio di etanolo una volta. Asciugare le perline. Eluire con 20 µ l di ddH2O. Eseguire un’aliquota del DNA su un gel di agarosio al 2% per confermare la dimensione degli ampliconi. Quantificare la concentrazione di DNA (Tabella materiali, pos. 3) per determinare la concentrazione delle librerie ECS separate. Piscina le librerie in quantità equimolari.Nota: ad esempio, i ricercatori possono pool otto biblioteche in un gruppo equimolare4 con 4 milioni a partire di molecole per il sequenziamento utilizzando una piattaforma di sequenziamento che uscite fino a 400 milioni di letture. Conservativamente, è consigliabile utilizzare una media di dieci letture crude per correzione di errore per molecole. Questo sarebbe prendere letture 360 milioni (4 milioni di molecole * 8 librerie * 10 legge per la correzione di errore). Con molecole uniche 4 milioni per libreria, ricercatori possono aspettarsi di ottenere un teorico medio di consensus leggere la copertura del 7042 volte al amplicone (4 milioni/568 ampliconi dal pannello di gene). Quantificare la concentrazione di DNA (Tabella materiali, pos. 3) per determinare la concentrazione della libreria ECS in pool. Presentare la libreria ECS riunita a circa 4 nM. Fornire le seguenti impostazioni di sequenziamento per piattaforme di sequenziamento Illumina (MiSeq, HiSeq o NextSeq): 2 x 144 accoppiato-fine legge, 8 cicli indice 1 e 16 indice 2 cicli. 2. Gene pannelli con correzione d’errore di sequenziamento del DNA Ibridazione dei oligos da pannelli di geneNota: In questo passaggio, si saranno costruire librerie di sequenziamento utilizzando un protocollo modificato Illumina TruSight o TruSeq per incorporare l’UNMIS (Tabella materiali, punto 17). Ibridare i oligos sul frammento genomic seguendo il protocollo del produttore. Uso 250 ng di DNA (o di qualsiasi quantità di materiale di partenza desiderata). Rimuovere i oligos unbound seguendo il protocollo del produttore. Eseguire estensione-legatura seguendo il protocollo del produttore.Nota: Le modifiche al protocollo del produttore iniziano di sotto. Incorporazione di i5 e i7 adattatori tramite PCR Preparare il mastermix PCR pipettando i seguenti reagenti in un tubo di dimensioni di volume appropriato: 37,5 µ l di Q5 Mastermix (Tabella materialipos. 1), 6 µ l di schede di 10 µM 16N i5 (dettagliate nel metodo 1, passaggio 1.2.2), 6 µ l di i7 adattatori (uso diverso i7 adattatori per campioni separati per multiplexing) e 22 µ l di soluzione di estensione-legatura con perline dal punto 2.1.3.Nota: Il Mastermix Q5 sostituisce la polimerasi mastermix fornito da Illumina. La polimerasi Q5 amplifica il frammento genomico con una maggiore fedeltà e meno errori introdotti. Eseguire il programma di PCR su un termociclatore utilizzando i seguenti parametri: 30 s a 98 ° C, 4 – 6 cicli di 10 s a 98 ° C, 30 s a 66 ° C, 30 s a 72 ° C; 2 min a 72 ° C e quindi tenere a 4 ° C.Nota: Il numero di cicli dipende la dimensione del pannello. Dalla nostra esperienza, una PCR 4-ciclo è sufficiente se il pannello di gene ha circa 1.500 diverse paia di gene specifico oligos, mentre un pannello con 500 – 600 paia di oligos richiede 6 cicli di PCR. Ripulire le reazioni di PCR con biglie magnetiche (tabella materiali, pos. 2): aggiungere la reazione di PCR per biglie magnetiche in una reazione di PCR 1 modificata: 0,75 rapporto di biglie magnetiche: Pipettare 56,25 µ l di soluzione di biglie magnetiche nel 75 µ l di prodotti di PCR dal punto 2.2.2. Trasferire il composto in una provetta di associazione basso da 1,5 mL. Mescolare accuratamente pipettando su e giù almeno 10 volte. Lasciare l’impasto a riposare a temperatura ambiente per 5 min. Posizionare il tubo su un supporto magnetico. Incubare per 2 min a temperatura ambiente o fino a quando il surnatante è chiaro. Rimuovere il surnatante. Lavare le perle con 200 µ l di etanolo al 70%. Incubare per 30 s. Rimuovi etanolo. Ripetere il passaggio di lavaggio di etanolo una volta. Asciugare le perline. Eluire con 20 µ l di ddH2O. Quantificare le librerie utilizzando QX200 ddPCR piattaforma. Seguire il passaggio 1.4 nel metodo 1.Nota: molecole 4 milioni sono stati normalizzati per esempio biblioteca4 nel risultato rappresentativo (Figura 2) al fine di ottenere una media teorica di 7.042 molecole in modo univoco indicizzate (4 milioni diviso per 568 oligos gene-specifico). Amplificare e normalizzare le librerie per il sequenziamento. Amplificare il numero desiderato di molecole mediante il seguente mastermix per la PCR finale per un totale di 50 µ l: 25 µ l di Q5 Mastermix, 2 µ l di Primer P5 (1 µM), 2 µ l di Primer P7 (1 µM) e 21 µ l delle molecole del DNA. Eseguire il programma di PCR su un termociclatore usando il seguente parametro: 30 s a 98 ° C; 16 cicli di 10 s a 98 ° C, 30 s a 66 ° C, 30 s a 72 ° C; 2 min a 72 ° C; quindi tenere a 4 ° C. Ripulire il sequenziamento librerie utilizzando biglie magnetiche (Tabella materiali, pos. 2): aggiungere la reazione di PCR per biglie magnetiche in una reazione di PCR 1 modificata: 0,75 rapporto di biglie magnetiche: Pipettare 37,5 µ l di soluzione di biglie magnetiche nei prodotti di PCR 50 µ l dal punto 2.4.2. Trasferire il composto in una provetta di associazione basso da 1,5 mL. Mescolare accuratamente pipettando su e giù almeno 10 volte. Lasciare l’impasto a riposare a temperatura ambiente per 5 min. Posizionare il tubo su un supporto magnetico. Incubare per 2 min a temperatura ambiente o fino a quando il surnatante è chiaro. Rimuovere il surnatante. Lavare le perle con 200 µ l di etanolo al 70%. Incubare per 30 s. Rimuovi etanolo. Ripetere il passaggio di lavaggio di etanolo una volta. Asciugare le perline. Eluire con 20 µ l di ddH2O. Eseguire un’aliquota del DNA eluita (~ 3 µ l) su un gel di agarosio al 2% per confermare la dimensione degli ampliconi. Quantificare la concentrazione di DNA (Tabella materiali, pos. 3) per determinare la concentrazione delle librerie ECS separate. Piscina le librerie in quantità equimolari. Fare riferimento al metodo 1 punto 1.5.6. e anche la discussione per ulteriori dettagli il pool. Presentare la libreria ECS riunita a circa 4 nM. Fornire le seguenti impostazioni di sequenziamento per piattaforme di sequenziamento Illumina (MiSeq, HiSeq o NextSeq): 2 x 144 accoppiato-fine legge, 8 cicli indice 1 e 16 indice 2 cicli. Analisi ed elaborazione di Bioinformatic ECS Ottenere il campione-demultiplexing letture dal sequencer o eseguire il demultiplexing delle prime sequenze letture in diversi campioni utilizzando i7 adattatore sequenze bioinformatically con uno script personalizzato. Tagliare i primi 30 nucleotidi di ogni lettura demoltiplicato per rimuovere oligo sequenze dal pannello di gene. Allineare le letture che condividono la stessa UNMIS uno a altro per formare famiglie lettura.Nota: I ricercatori possono utilizzare software compatibile con UMI come Mastrapasqua13 per estrarre lettura famiglie. Nessuna distanza di hamming è stato permesso all’interno della sequenza UMI in questo esperimento per aumentare la specificità del metodo. Eseguire la de-duplicazione e correzione degli errori utilizzando i seguenti parametri consigliati. ≥ 5 uso leggere coppie nella stessa famiglia. È consigliato un minimo di tre paia di lettura. Confrontare del nucleotide in ogni posizione in tutte le letture della stessa famiglia di lettura e generare un nucleotide di consenso se c’è almeno il 90% concordanza tra le letture per il particolare del nucleotide. Chiamare un N se è inferiore a 90% accordo per posizione del nucleotide. Scartare le letture di consenso che hanno > 10% del numero totale di nucleotidi di consenso viene chiamato come N. Allineare tutte le letture di consenso mantenuti localmente per hg19 o hg38 genoma umano riferimento utilizzando il aligner(s) preferito del ricercatore come Bowtie2 e BWA. Processo allineato letture con Mpileup utilizzando i parametri – BQ0 – d 10,000,000,000,000 per rimuovere soglie di copertura per garantire un output corretto pileup indipendentemente dal VAF. Filtrare le posizioni con meno di 1000 x consenso, leggere la copertura.Nota: Il ricercatore determina la copertura minima per ogni posizione del nucleotide arbitrariamente, si consiglia di avere almeno 500 consenso x leggere la copertura per l’analisi a valle. Utilizzare distribuzione binomiale per chiamare varianti di singolo nucleotide (SNPs) in dati conservati dal passaggio 2.5.7 con i seguenti parametri. La statistica binomia si baserà su un modello di genomica errore di posizione-specifiche. Ogni posizione genomica è modellato in modo indipendente dopo sommando i tassi di errore di tutti i campioni per quella particolare posizione. Seguendo l’esempio:Probabilità del profilo del nucleotide in una determinata posizione genomica, p∑ Variante RF2 ∑ totale RFs= 26/255505= 0.000101759Probabilità binomiale della variante 24 RFs fuori 35911 RFs totale, P(X ≥ x) nell’esempio K= 1 – binomial(24, 35911, 0.000101759)= 2.26485E-13Nota: Per ogni posizione genomica interrogato, ci sarebbero tre possibili cambiamenti mutazionali (cioè,A > T, A > C, A > G), e ognuno dei quali sarebbe rappresentato come elemento di sfondo. Vengono mantenuti gli eventi somatici che sono significativamente diversi dallo sfondo dopo la correzione di Bonferroni. Nell’esempio riportato nella tabella 1, il numero di test eseguiti era 11, quindi un Bonferroni corretti p-valore ≤0.00454545 (0,05/11) è stato richiesto di chiamare un evento come statisticamente significativo. Eventi somatici sono tenuti ad essere presenti in entrambi replicati dallo stesso campione; in caso contrario, li considerano come falsi positivi. Tabella 1: Esempio che illustra il modo di costruire un modello binomiale errore posizione specifica. 3. correzione d’errore sequenziamento del RNA Oltre a valutare per le mutazioni a livello del DNA, è possibile integrare ECS con vari pannelli di RNA di sequenziamento mirati per rilevare la trascrizione di abbondanza rara o basso livello di RNA. Combinando ECS con i pannelli di sequenziamento di RNA di Qiagen shelf, abbiamo dimostrato digitale quantificazione dell’espressione genica per trascrizioni con minor come dieci copie senza necessità di normalizzazione contro un gene housekeeping. UNMIS necessaria per la correzione di errore sono stati integrati nel pannello. Eseguire l’estrazione di RNA totale (Tabella materiali, punto 20). Eseguire Preparazione libreria ECS-RNA secondo il protocollo del produttore (Tabella materiali, Item 19). Eseguire pipeline di bioinformatica secondo passo 2.5.1–2.5.6. 2 Metodo delineato nella sezione precedente. Dopo passo 2.5.6, il numero di letture di consenso allineati al gene rappresenta il livello di espressione del gene senza la necessità di normalizzazione di lunghezza del gene.