Uso de anticorpos Antifosfo-girdin Visualizar células intestinais topete no Mouse flutuante Jejunum Cryosections

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de utilização do Instituto para a investigação do desenvolvimento, centro de serviços humanos de Aichi e cuidado Animal (número do pedido: M-03). 1. preparações Prepare-se 10 L de soro de tampão fosfato (PBS): 32,27 g de Na2HPO4·12H2O, 4,5 g de NaH2PO4·2H2O, 80,0 g de NaCl adicionado à água ultrapura para um volume final de 10 L. loja solução, à temperatura ambiente (RT). Prepare 200 mL de PBS-t: 200 mL de PBS da etapa 1.1 com 100 µ l de polyoxyethylene(10) octilfenil éter para uma concentração final de 0,05% (vol: Vol). Loja em RT. Enquanto usava luvas e óculos de proteção, preparar 50 mL de 15% de sacarose em solução de formol neutro a 10% tamponada: 7,5 g de sacarose adicionada a 10% tamponada solução formalina neutra (Tabela de materiais) para um volume final de 50 mL. Loja em RT.Cuidado: Inalação e/ou pele/olho contato com formaldeído em solução de formol neutro a 10% tamponada pode ser perigoso. Manipular com cuidado. Prepare-se 1,5 mL de 200 unidades/mL corante fluorescente-faloidina conjugado de solução: faloidina-fluorescente tingem o conjugado (300 unidades em 1 frasco, sólidos liofilizados, excitação e emissão de comprimentos de onda: 581 nm e 609 nm, respectivamente) suspenso em 1,5 mL de metanol. Solução de armazenamento no escuro a-20 ° C. Prepare-se 5 mg / mL 4′, 6-diamidino-2-phenylindole, dicloridrato (DAPI) solução de reserva: 10 mg de DAPI em 2 mL de N, N-dimetilformamida (DMF). Solução de armazenamento no escuro a-20 ° C. Prepare-se 5% albumina de soro bovino (BSA) em PBS: 0,5 g de BSA, 10 mL de PBS. Loja a 4 ° C. Retire a ponta chanfrada, de uma agulha de calibre 18 reta usando uma pinça e aperte as beliscadas final com um pincher no sentido longitudinal para permitir que o líquido a fluir através do lúmen da agulha (figura 1A1).Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. 2. animal dissecção e o isolamento do jejuno Fixação de perfusão de um rato Utilize luvas e trabalhe numa área bem ventilada. Preparar um copo de vidro de 100 mL, 10% tamponada solução de formalina neutra, instrumentos cirúrgicos (tesouras, pinças), um tabuleiro metálico, nylon 6-0 corte suturas, uma agulha de calibre 18 reta preparada como 1.7, uma agulha de calibre 22 alada, uma seringa de 20 mL. Carregar 20 mL da solução de formol neutro a 10% tamponada do copo de vidro para a seringa de 20 mL e conecte a agulha de calibre 22 alada à saída do. Prepare a gelatina líquida, acrescentando 1 g de pó de gelatina a 20 mL de PBS (final 5% gelatina) num tubo de centrífuga de 50 mL. Após a imersão em RT por 15 min, incube a 50 ° C em banho-maria por 15 min sem tremer. Brevemente o vórtice e incubar a 50 ° C por mais 15 minutos dissolver completamente a gelatina. Deixe o tubo em RT até o uso. Eutanásia em um rato adulto por deslocamento cervical. Coloque o mouse da etapa 2.1.6 em uma bandeja metálica e faça uma pequena incisão na pele através da cartilagem ensiform usando instrumentos cirúrgicos. Expanda a incisão com as duas mãos para expor as regiões torácicas e abdominais. Abrir o peritônio para expor o diafragma e em seguida, abra o diafragma em ambos os lados. Corte a caixa torácica na linha axilar anterior de ambos os lados e, em seguida, remover a parede torácica pela corte no sentido transversal na posição do timo para expor o coração. Faça uma pequena incisão da aurícula do átrio direito para drenar o sangue e inserir uma agulha de calibre 22 alada do ápice do ventrículo esquerdo. Empurre o êmbolo para perfundir os tecidos com solução de formol neutro a 10% tamponada. Depois de expor os órgãos na pélvis, cortar a extremidade do reto do ânus e separar os intestinos do corpo cortando o mesentério. Para isolar o jejuno, corte os intestinos a 4 cm do lado anal do antro gástrico. Descarte a anal metade do intestino delgado remanescente. Clip do jejuno ao meio para facilitar o procedimento de lavagem. Carga 20 mL de 10% solução de formalina neutra do tampão para a seringa de 20 mL e anexar a 18 reta agulha preparada na etapa 1.7 para a tomada. Injecte a solução de neutro de formalina 10% tamponada de uma ponta de jejuno recortado para expulsar o conteúdo intestinal e fixar a superfície de lúmen do intestino (figura 1A2). Lave o lúmen do intestino através da injeção de PBS conforme descrito na etapa 2.1.15. Lave a gelatina líquida no lúmen do intestino, conforme descrito na etapa 2.1.15 para substituir PBS com gelatina líquida. Fechar uma das extremidades do jejuno recortado pela ligadura de sutura utilizando um nylon 6-0 corte sutura, encha o jejuno com gelatina líquida e feche a extremidade oposta pela ligadura de sutura (figura 1A3). Adicione quatro pontos de sutura para caber uma seção em forma de salsicha jejuno à parte deprimida de uma cryomold (figura 1A4).Nota: Para cryomolds com uma 20 x 25 mm x 5 mm deprimido seção, uma seção de salsicha-como jejuno ~ 20 mm é preferível. Mergulhe os tecidos em 50 mL de 15% de sacarose em solução de formol neutro a 10% tamponada durante a noite a 4 ° C.Nota: Estes passos assegurar cryoprotection por sacarose e proteína de fixação por formalina de gelatina e tecido. Formalina-gelatinizado gelatina não derrete em RT, Considerando que a gelatina gelatinizada não fixa a 4 ° C derrete no RT 3. encaixe o congelamento dos tecidos jejuno cheio de gelatina Cortando o jejuno nos pontos de sutura, três pedaços de salsicha, como jejuno com ambas as extremidades ligados são obtidos (figura 1A4). Alinhe os pedaços de salsicha, como em um cryomold para além da incorporação de compostos para preparação de amostras congeladas. Snap congelar o cryomold em isopentano arrefecido com nitrogênio líquido. Loja cryomolds a-80 ° CNota: O protocolo pode ser pausado aqui. 4. imunofluorescência de tufo células usando Cryosections flutuantes Cryosectioning Defina a temperatura da câmara do criostato (CT) e a temperatura do objeto (OT)-22 ° c. Lugar do tecido congelado bloco em um cryomold na câmara do criostato pelo menos 15 min. Adicione 3 mL de PBS para um prato de cultura 35mm. Remover o bloco de tecido congelado da cryomold e cortar o bloco ao meio com uma lâmina de barbear para expor a seção transversal do jejuno. Montar uma metade do bloco em um mandril (um adaptador criostato), a seção do plano de corte com a lâmina de barbear. Seção do jejuno cheia de gelatina em 30 seções µm de espessura. Uso congelada fórceps para transferir suavemente as seções para o prato de 35mm cultura preparado na etapa 4.1.2 (Figura 2Bcerto). Aplicação de anticorpos primários Lave as seções flutuantes no prato 3 vezes durante 5 min cada com 3 mL de PBS-T com agitação suave num agitador recíproco 35mm cultura (aproximadamente 36 vezes / min). Preparar a solução de recuperação de antígeno: 0,3 mL de concentrado de solução de recuperação do antígeno (Tabela de materiais) em 2,7 mL de água ultrapura. Adicione 3 mL de solução de recuperação de antígeno para o prato de 35mm cultura contendo seções flutuantes. Feche a tampa, selar a abertura entre o prato e a tampa com uma tira de fita de vinil e incubar a 50 ° C em uma incubadora de hibridização para 3h sem tremer. Retire o prato da incubadora e cool no RT por 20 min. Depois de retirar a fita de vinil, lave as seções 3 vezes durante 5 min cada com 3 mL de PBS-T e agitação suave. Aspirar o PBS-T e adicionar 5 gotas de solução de bloqueio (Tabela de materiais) para as seções. Incube a RT por 5 min com agitação suave. Preparar a solução de anticorpo primário: 495 µ l de BSA de 5% em PBS com 5 µ l de fosfo-Y1798 girdin (pY1798) anticorpos (Tabela de materiais). Adicione 500 µ l de solução de anticorpo primário sobre as seções (a solução de bloqueio não precisam ser removidos). Coloque o prato em uma câmara de incubação umidificado e incubar durante uma noite a 4 ° C, com agitação suave.Nota: A incubação durante a noite pode ser estendida para até três noites. Aplicação de anticorpos secundários Lave as seções 3 vezes durante 5 min cada em 3 mL de PBS-T com leve agitação. Preparar a solução diluída DAPI: 2 µ l de solução-mãe de DAPI (passo 1.5), 998 µ l de PBS. Fazer a solução de anticorpo secundário: 476 µ l de BSA de 5% em PBS, 10.5 µ l de solução diluída de DAPI, 12,5 µ l de conjugado solução corante fluorescente-faloidina, 1 µ l de conjugado de tintura cabra anti-coelho IgG-fluorescente (comprimento de onda: excitação 496 nm, emissão de 520 nm). Depois de aspirar a PBS-T, aplicar a solução de anticorpo secundário e incubar em uma câmara de incubação luz blindado em RT por 30 min com agitação suave. Lave as seções 3 vezes durante 5 min cada com 3 mL de PBS-T e agitação suave. Após a lavagem final, retire o PBS-T e substitua com 3 mL de PBS falta polyoxyethylene(10) octilfenil éter. Transferi a cápsula para um microscópio estereoscópico. Lugar de 200 µ l de PBS em uma gota no centro de uma seção vidro branco revestido MAS slide e transferência um jejuno do prato para a gota usando uma ponta da pipeta P200. Depois de ajustar o alinhamento de seção sob o microscópio estereoscópico, Aspire todos os restantes PBS em torno da seção. Adicionar 20 µ l de mídia de montagem aquoso e coloque uma lamela de 20 x 20 mm no topo da mídia. Imediatamente sele as bordas de lamela com mídia de montagem baseada em xilol. Coloque o slide em uma madeira mappe e permitir que a mídia de montagem baseada em xileno a solidificar no RT para 2-3 h.Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Depois que a mídia de montagem baseada em xileno se solidifica, os slides podem ser armazenados por 2-3 semanas em uma caixa de luz-blindado slide na RT 5. Confocal da microscopia Coloque óleo de imersão sobre o objectivo X 63 de um microscópio confocal. Desliguem o lamela-slide e colocar o slide no palco. Digitalizar as imagens de TC adquiridas à laser de comprimentos de onda 405, 488 e 555 nm e salvar as imagens em formato tiff (. TIFF).Nota: Escolher um conjunto de filtro de deteção que é apropriado para as tinturas de fluorescência (ou seja, maxima de excitação/emissão: 358/461 nm, 490/525 e 590/617).