Ürünleri ve tüm hücre yama kelepçe kayıt Xenopus laevis Tectal nöronlar için iletişim kuralları
Summary
Bu yazıda, Xenopus laevis Kurbağa yavrularını retinotectal devre eğitim için tüm cep telefonu yama kelepçe kaydetmek için kullanılan üç beyin hazırlıkları görüşmek. Kendi belirli avantajları ile her hazırlık Xenopus iribaş deneysel tractability nöral devre işlevi incelemek için bir model olarak katkıda bulunmaktadır.
Abstract
Hangi formu synapses doğrudan üzerine nöronlarda optik tectum göz retina ganglion hücrelerinin (RGCs) oluşan Xenopus iribaş retinotectal devre nasıl sinir devreleri çalışma popüler modelidir kendini topla. Bütün taşıma yeteneği yama kelepçe kayıtları tectal nöronlar ve RGC uyarılmış yanıt, ya da içinde vivo hücre veya tüm beyin hazırlık kullanarak büyük bir vücut, normal yatan mekanizmaları yüksek çözünürlüklü verilerin üretti ve anormal, devre oluşumu ve işlev. Burada nasıl vivo içinde hazırlık, özgün tüm beyin hazırlık gerçekleştirileceğini açıklar ve daha yakın zamanda yatay beyin dilim hazırlık tectal neurons tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları elde etmek için geliştirilmiştir. Her hazırlık benzersiz deneysel avantajları vardır. Vivo hazırlık tectal nöronlar doğrudan yanıt göz yansıtılan görsel uyaranlara karşı kayıt sağlayan. Tüm beyin hazırlık için son derece kontrollü bir şekilde var olmak harekete geçirmek RGC akson, ve yatay beyin dilim hazırlık kaydından tectum tüm katmanları arasında sağlar.
Introduction
Retinotectal devre amfibi görsel sisteminin önemli bileşenidir. Hangi onların aksonlar optik tectum nerede postsinaptik tectal nöronlar ile sinaptik bağlantıları oluşturmak için proje RGCs gözünde, oluşur. Xenopus iribaş retinotectal devre nöral devre oluşumu ve işlev eğitim için popüler bir gelişim modelidir. Bu kurbağa’nın retinotectal devrenin bir güçlü deneysel model1,2,3render birçok özniteliği vardır. Bir büyük öznitelik ve odağı bu makalenin tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları tectal nöronlar, içinde VIVO veya tüm beyin hazırlık kullanarak yürütmek için yeteneği var. Gerilim ve akım kayıt modları kelepçe destekler bir amplifikatör ile donatılmış bir Elektrofizyoloji sondaj platformu ile tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları bir nöron’ın Elektrofizyoloji yüksek çözünürlükte karakterize edilebilir izin verir. Sonuç olarak, tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları tectal nöronlar retinotectal devre oluşumu temel aşamaları boyunca geliştirme detaylı ve kapsamlı bir anlayış ve plastisite içsel4,5 hazırladık , 6 , 7 ve sinaptik8,9,10,11 özellikleri. Tüm cep telefonu yama kelepçe tectal nöron kayıtları birleştirerek, genlerin veya morpholinos bu nöronların12ve kurulan görsel kaçınma testi13 ile görsel destekli davranışını değerlendirmek için bir yöntem ilgi ifade yeteneği teşvik molekülleri, devre fonksiyon ve davranışı arasındaki bağlantıları tanımlaması.
Tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları elde veri çünkü genetik kalsiyum göstergesi GCaMP6, gibi daha yeni görüntüleme yaklaşımları kullanarak mümkün değildir yüksek çözümleme türü bulunmakla birlikte kalsiyum göstergeler kullanarak görüntüleme verir unutmamak gerekir Kalsiyum dynamics büyük popülasyonlarda nöronların arasında aynı anda, orada hayır doğrudan veya özel elektrik parametreleri somata delta Floresans ölçerek elde edilebilir ve gerilim bir yolu yoktur belirgin şekilde kelepçe ölçmek için nöron akım-gerilim ilişkileri. Açıkça bu ayrı iki yaklaşım, Elektrofizyolojik kayıtlar ve kalsiyum görüntüleme, üst üste güçlü sahip ve farklı veri oluşturmak. Bu nedenle, en iyi yaklaşım belirli deneysel soru ele alınmaktadır bağlıdır.
Burada, biz tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları bir vivo içinde hazırlık, tüm beyin hazırlık, kullanarak iribaş optik tectum nöronlar edinme için bizim yöntem tanımlamak ve daha yeni bir14 bizim laboratuarımızda geliştirildi tüm beyin hazırlık modifiye . Temsilcisi sonuçları bölümünde her hazırlık ve elde edilebilir veri farklı türde deneysel avantajları göstermektedir. Sınırları ve güçlü ipuçları sorun giderme, yanı sıra farklı ürünleri bir tartışma bölümünde dahil edilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada açıklanan tüm yöntemleri tectal Kurbağa yavrularını gelişimsel sahne 42 ve (Neiuwkoop ve Faber15göre sahnelenen) 49 arasında neurons kaydetmek için optimize edilmiştir. Sahne 42 ile Kurbağa yavrularını yeterince büyük ve yeterince gelişmiş böylece böcek pimleri beyin vivo kayıtları için ve tüm beyin diseksiyon taşımak için her iki tarafında yerleştirilebilir. Daha önceki aşamalarında, Kurbağa yavrularını aslında iki boyutlu olduğunda (…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SBC COBRE 1P20GM121310-01 NIH grant tarafından desteklenen.
Materials
| Stemi Stereo 508 | Zeiss | 495009-0006-000 | Dissecting microscope |
| MS-222 "Tricane" | Finquel | ARF5G | Amphibian general anesthetic |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-1KG | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO3)•4H2O) | Sigma-Aldrich | 237124-500G | Used to prepare Stienberg's solution |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare Steinberg's solution |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | Used to prepare external recording solution |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | J.T. Baker | 2444-01 | Used to prepare external recording solution |
| D-glucose Anhydrous | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare external recording solution |
| Tubocurarine hydrochloride pentahydrate | Sigma | T2379 | Nicotinic acetylcholine receptor antagonist |
| Insect Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1mm diameter stainless steel pins |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761028 | Preweighed monomer and curing agent kit |
| Sterile Polystyrene Petri Dish – 60x15mm | Fisher Scientific | AS4052 | Small petri dishes |
| PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm) | BD | 305122 | Syringe needles |
| 1mL Slip Tip Tuberculin Syringe | BD | 309659 | Disposable, sterile syringes |
| Borosilicate pipette glass | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | Pulled to desired specifications using pipette pulling machine |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | Fabricates micropipettes for electrophysiology recording |
| Kimwipes Kimtech wipes | Kimberly-Clark | 34120 | Delicate task lint-free wipers |
| Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | Current clamp and voltage clamp headstage |
| MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop Controller | Sutter Instrument | MP-285/T | Control for headstage on electrophysiology rig |
| Fiber-Coupled LED (Green) | Thorlabs | M530F2 | Fiber optic cable paired with green LED |
| Cluster Bipolar Electrode (25µm diameter) | FHC | 30207 | Bipolar stimulating electrode |
| ISO-Flex Stimulator | A.M.P.I. (Israel) | Contact manufacturer | Flexible stimulus isolator |
| Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier | Molecular Devices | 2500-0157 | Amplifier for voltage- and current-clamp recording |
| Digidata 1322A digitizer | Molecular Devices | 2500-135 | Data acquisition system for electrophysiology recording |
| Axio Examiner.A1 | Zeiss | 491404-0001-000 | Microscope for electrophysiology |
| Micro-g Lab Table | TMC | 63-533 | Air table for electrophysiology microscope |
| Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bit | Dell | D06D001 | Computer running electrophysiology software |
| c2400 CCD camera | Hamamatsu | 70826-5 | Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging |
| 7 O'Clock Super Platinum Stainless Razorblades | Gillette | CMM01049 | Platinum-coated stainless razor blades |
| Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-711-7M | Disposable Polyethylene transfer pipets |
References
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).
- Pratt, K. G. Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole. Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).
- Liu, Z., Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Early development and function of the Xenopus tadpole retinotectal circuit. Curr. Opin. Neurobiol. 41, 17-23 (2016).
- Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Region-specific regulation of voltage-gated intrinsic currents in the developing optic tectum of the Xenopus tadpole. J. Neurophysiol. 112 (7), 1644-1655 (2014).
- Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Homeostatic regulation of intrinsic excitability and synaptic transmission in a developing visual circuit. J. Neurosci. 27 (31), 8268-8277 (2007).
- Cialeglio, C. M., Khakhalin, A. S., Wang, A. F., Constantino, A. C., Yip, S. P., Aizenman, C. D. Multivariate analysis of electrophysiological diversity of Xenopus visual neurons during development and plasticity. Elife. 4, 11351 (2015).
- Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo. Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).
- Wu, G., Malinow, R. Cline H.T. of a central glutamatergic synapse. Science. , 972-976 (1996).
- Van Rheed, J. J., Richards, B. A., Akerman, C. J. Sensory-evoked spiking behavior emerges via an experience-dependent plasticity mechanism. Neuron. 87 (5), 1050-1060 (2015).
- Schwartz, N., Schohl, A., Ruthazer, E. S. Activity-dependent transcription of BDNF enhances visual acuity during development. Neuron. 70 (3), 455-467 (2011).
- Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J. Vis. Exp. (17), e705 (2008).
- Dong, W., et al. Visual avoidance in Xenopus tadpoles is correlated with the maturation of visual responses in the optic tectum. J. Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
- Hamodi, A. S., Pratt, K. G. The horizontal brain slice preparation: a novel approach for visualizing and recording from all layers of the tadpole tectum. J. Neurophysiol. 113 (1), 400-407 (2015).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J. Vis. Exp. (112), e54024 (2016).
- Muldal, A. M., Lillicrap, T. P., Richards, B. A., Akerman, C. J. Clonal Relationships Impact Neuronal Tuning within a Phylogenetically Ancient Vertebrate Brain Structure. Curr. Biol. 24 (16), 1929-1933 (2014).
- Khakhalin, A. S., Koren, D., Gu, J., Xu, H., Aizenman, C. D. Excitation and inhibition in recurrent networks mediate collision avoidance in Xenopus tadpoles. Eur. J. Neurosci. 40 (6), 2948-2962 (2014).
- Ruthazer, E. S., Aizenmann, C. D. Learning to see: patterned visual activity and the development of visual function. Trends Neurosci. 44 (4), 183-192 (2010).
- Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Multisensory integration in mesencephalic trigeminal neurons in Xenopus tadpoles. J. Neurophysiol. 102 (1), 399-412 (2009).
