Derleme ve prototip köpüklü virüs Intasomes arıtma
Summary
Rekombinant retroviral integrase ve DNA reaksiyonlar viral DNA uçları taklit eden bir intasome bilinen bir enzimatik etkin kompleks oluşabilir. Intasomes biyokimyasal, yapısal ve Kinetik çalışmalar için kullanılır. Bu protokolü nasıl bir araya getiren ve prototip köpüklü virüs intasomes arındırmak ayrıntılı.
Abstract
A özelliği ve gerekli adım retrovirüsü yaşam döngüsünün tanimlar viral genom entegrasyon ana bilgisayar genom. Tüm Retrovirüsler kovalent ana bilgisayara strand transfer olarak bilinen DNA viral birleştirilmesi tromboksan integrase (IN) enzim kodlamak. Entegrasyon modellenmiş vitro rekombinant retroviral inç ile olmak ve viral genom uçları taklit eden DNA reaksiyonlar olabilir. Daha yakından vivo içindeentegrasyon oluşur Tümleştirme tepki özetlemek için kompleksleri rekombinant inç ve sentetik reaksiyonlar diyaliz azaltılmış tuz konsantrasyonu arabellekte tarafından monte edilir. Entegrasyonu karmaşık, bir intasome olarak adlandırılan boyut dışlama Kromatografi tarafından saf. Prototip köpüklü virüs (PFV), söz konusu olduğunda intasome inç bir tetramer ve iki DNA reaksiyonlar ve kolayca monomeric inç ve ücretsiz oligomer DNA ayrılır. PFV intasomes entegrasyon verimliliği daha iyi dinamiklerini anlamak için deneysel koşullar çeşitli ve mekanik retroviral entegrasyon altında denetlesinler.
Introduction
Ana bilgisayar genom viral genom entegrasyonu döngüsündeki tüm Retrovirüsler1zorunlu bir adımdır. Viral enzim integrase (IN) viral DNA genom DNA ağırlamaktan her iki ucuna kovalent katılmadan tromboksan. Hücresel bir enfeksiyon sırasında Tümleştirme aracılık eder öncesi entegrasyonu karmaşık bir parçasıdır. Rekombinant inç viral DNA uçları taklit çift iplikçikli DNA reaksiyonlar ile complexed da bir hedef DNA vitro2entegrasyon gerçekleştirebilirsiniz. Bir ortak Tümleştirme tahlil vitro supercoiled plazmid DNA hedef kullanır. Her iki viral DNA reaksiyonlar (vDNA) için plazmid bütünleştirilmesi doğrusal bir üründe sonuçları ve uyumlu entegrasyon (şekil 2A) olarak adlandırılır. Entegrasyon tahlil vitro da tek bir vDNA kovalent rahat bir daire içinde sonuçlanan hedef plazmid katıldı ile ürün verim. Bu yarı-site Tümleştirme ürün tahlil içinde in vitrobir eşya gibi görünüyor.
Rekombinant inç ve vDNA entegrasyonu vitrogerçekleştirebilir, ama monomeric inç ilgili görselleştirme karanlık onlar Tümleştirme kompleksleri yapısını veya çalışması dinamikleri ile ideal Kimyasalları değil. Arıtılmış Tümleştirme kompleksleri veya “intasomes,” dinamik tek molekül analiz veya yapısal çalışmalar için gereklidir. PFV inç ve vDNAs diyaliz tarafından bir daha düşük tuz konsantrasyonu3,4‘ e bir nispeten yüksek tuz konsantrasyonu arabelleğinden monte. Diyaliz, bir çökelti sırasında formları. Bu çökelti diyaliz kaldırılır ve tuz konsantrasyonu artar. Yüksek tuz konsantrasyonu acele içeren PFV intasomes solubilizes. İntasomes o zaman boyutu dışlama Kromatografi (sn) tarafından saf. Rekombinant prototip köpüklü virüs (PFV) inç 225 µM5konsantrasyonlarda çözümde bir monomer olarak bulunmaya gösterilmiştir. SN ayırma etkili bir tetramer PFV inç ve iki vDNAs içeren PFV intasomes (225.5 kDa), monomeric PFV (44,4 kDa) ve ücretsiz vDNA (24.0 kDa) ayırır. PFV intasomes dondurulmuş olabilirler ve en az altı ay-80 ˚C, Muhafazası için Tümleştirme etkinliğini korumak.
Rekombinant PFV intasomes de amino asit oyuncu değişikliği veya kesilme mutasyonlar veya fluorophores veya biotin4,6ile etiketli vDNAs içerecek şekilde değiştirilmiş. Saf PFV intasomes kolayca supercoiled plazmid hedef DNA vitroentegrasyonu gerçekleştirmek. Toplu biyokimyasal Tümleştirme deneyleri ile intasomes etkilerini mutasyonların inhibitörleri veya diğer maddeleri, kimyevî test. Biotinylated intasomes nükleik asit veya proteinler ile ilgi soruşturma için kullanılabilir. PFV intasomes iki vDNA ucu veya intasome arama hedef görselleştirmek için toplam iç yansıma Floresans katılmadan arasında geçen zamanı ölçmek için manyetik cımbız tarafından tek molekül mikroskobu analiz için izin ortam sıcaklığında işlevsel olduğundan DNA6. Ayrıca, PFV intasomes ilk yapısal olarak olacak önemli ölçüde etkileyen retroviral entegrasyon3alan ile karakterize edildi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Retroviral Ins entegrasyonu gerçekleştirmek için ve viral ömrünün devam viral genomik DNA ile karmaşık bir multimeric oluştururlar. Monomer intasome başına sayısı tetramers, octamers ya da muhtemelen daha yüksek sipariş multimers11,12,13,14olabilir. PFV intasomes3. bir tetramer rekombinant viral genomik DNA taklit çift iplikçikli DNA reaksiyonla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser NIH AI099854 ve AI126742 için anahtar tarafından desteklenmiştir.
Materials
| DNA Oligomers | IDT | N/A | Custom DNA Oligos |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | Sigma-Aldrich | Z677094-24EA | 3 kDa MWCO |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G37-20 | |
| Gel-loading tips, 1 – 200 μL | Corning | CLS4853-400EA | |
| Razor blade; Single-edged; 100/Pk.; Pack of 100 | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 568-0020 | |
| Dialysis tubing clips | Spectrum Labs | 132734 | |
| 6-8 kDa 10 mm Dialysis Tubing | Spectrum Medical | 132645 | |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517201 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Hyladder 10kb, 500 lanes | Denville Scientific | CB4225-4 |
References
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. . Retroviruses. , (1997).
- Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).
- Hare, S., Gupta, S. S., Valkov, E., Engelman, A., Cherepanov, P. Retroviral intasome assembly and inhibition of DNA strand transfer. Nature. 464 (7286), 232-236 (2010).
- Li, M., Lin, S., Craigie, R. Outer domains of integrase within retroviral intasomes are dispensible for catalysis of DNA integration. Protein Sci. 25 (2), 472-478 (2016).
- Gupta, K., et al. Solution conformations of prototype foamy virus integrase and its stable synaptic complex with U5 viral DNA. Structure. 20 (11), 1918-1928 (2012).
- Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nat Commun. 7, 11409 (2016).
- Lopez, M. A., Mackler, R. M., Altman, M. P., Yoder, K. E. Detection and removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Vis Exp. , (2017).
- Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
- Poirier, M. G., Bussiek, M., Langowski, J., Widom, J. Spontaneous access to DNA target sites in folded chromatin fibers. J Mol Biol. 379 (4), 772-786 (2008).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Ballandras-Colas, A., et al. Cryo-EM reveals a novel octameric integrase structure for betaretroviral intasome function. Nature. 530 (7590), 358-361 (2016).
- Ballandras-Colas, A., et al. A supramolecular assembly mediates lentiviral DNA integration. Science. 355 (6320), 93-95 (2017).
- Passos, D. O., et al. Cryo-EM structures and atomic model of the HIV-1 strand transfer complex intasome. Science. 355 (6320), 89-92 (2017).
- Yin, Z., et al. Crystal structure of the Rous sarcoma virus intasome. Nature. 530 (7590), 362-366 (2016).
- Maertens, G. N., Hare, S., Cherepanov, P. The mechanism of retroviral integration from X-ray structures of its key intermediates. Nature. 468 (7321), 326-329 (2010).
- Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).
